Приготовление растворов.

1. 100 г трехзамещенного фосфата натрия растворяют в 800 мл
дистиллированной воды и доводят объем раствора до 1 л.

2. 6 мл концентрированной соляной кислоты добавляют к 94 мл
дистиллированной воды.

Никогда не добавлять воду в кислоту!

¹ Ускорение центрифугирования («относительная сила центрифугирования» (ОСЦ)) измеряется в относительных единицах к ускорению свободного падения «g». Формула расчета ОСЦ:

ОСЦ=1,12 Rmax (об/мин /1000)², где Rmax - максимальный радиус от центра вращения ротора до дна пробирки в мм.

Например, при Д=180 мм и 1500 об/мин (центрифуга ЦЛ1-3) ОСЦ=450 g. При увеличении частоты вращения до 3000 об/мин ОСЦ возрастает до 1800 g.

Необходимое число оборотов в мин. можно рассчитать по формуле:

Об.мин¹ = 1000л/.(ОСЦ / (1,12 R max))

4.1.1.2 Обработка материала 3% серной кислотой

Общее время обработки кислотой не должно превышать 20 мин!

Несмотря на то, что микобактерий туберкулеза не теряют жизнеспособности в сильно закисленной среде, необходимо помнить, что длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты губительно действует на микобактерий. Поэтому раствором серной кислоты производят обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры. Этот метод рекомендован для обработки мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр.

При обработке 3% раствором серной кислоты рекомендуется следующий порядок манипуляций:

1. Для работы правильно собранный материал (60 —100 мл)
используют целиком для получения осадка, так как микобактерий,
имея удельный вес близкий к 1,0, могут подолгу не оседать, находясь
во взвешенном состоянии.

2. Из этого материала методом наслоения поэтапным
центрифугированием получить осадок. Для этого перенести в 1 - 2
центрифужные пробирки приблизительно по 15—20 мл материала.

3. Уравновесить пробирки и центрифугировать материал при 3000
xgB течение 15 мин.

4. Надосадочную жидкость отобрать пипеткой на 10 — 5 мл и
перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в
каждой пробирке 0,8-1,2 мл осадка.

5. Полученные в разных пробирках осадки одного и того же
материала с помощью той же стерильной пипетки перенести в одну
пробирку, плотно закрыть ее пробкой и встряхнуть.

6. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором.

7. К полученному осадку добавить равный объем 3% раствора
серной кислоты.

8. Выдержать полученную с кислотой смесь 10 мин при комнатной
температуре (не превышать время экспозиции!).

9. Центрифугировать смесь при 3000 g в течение 10 мин (не
превышать время экспозиции!).

10. Стерильной пипеткой на 5 — 10 мл отобрать надосадочную
жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором,
оставив приблизительно 0,8 — 1,2 мл осадка.

11. К осадку добавить стерильной пипеткой 15 мл стерильного
0,9 % раствора хлористого натрия.

12. Пробирки уравновесить и повторно центрифугировать
материал при 3000 g в течение 1 5 мин.

13. Стерильной пипеткой на 5 - 10 мл отобрать надосадочную
жидкость и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором,
оставив приблизительно 1,5 мл осадка.

 

14. Добавить в пробирку 1-2 капли 4% едкого натра до получения
нейтрального значения рН, определяемого индикаторной бумажной
полоской.

15. Встряхнуть пробирку с осадком и поместить в штатив,
расположив ее по порядку регистрационных номеров материала.

Далее см. разделы 2.1 Процедура посева и 2.2. Инкубация и др.

Реактивы:

1. Серная кислота (H2SO4) концентрированная — ГОСТ 4204 — 77;

2. Едкий натр (NaOH) — ГОСТ 4328 - 77;