Основные вехи развития методологии культивирования клеток1885 - Ру (Roux) показал, что клетки куриного эмбриона сохраняют жизнеспособность в солевом растворе вне тела животного. 1907 - Xаррисон (Harrison) культивировал спинной мозг амфибий в сгустке плазмы. Он пытался показать, что аксоны образуются в виде выростов отдельных нервных клеток. 1909 – А. Максимовский (Россия) постулировал существование стволовой кроветворной клетки. На заседании Общества Гематологов в Берлине 1 июня 1909 года он ввёл понятие «Stammzelle», подразумевая под этим определением лимфоцит в более широком значении этого слова, как клетку, способную быть стволовой в современном понимании этого слова 1910 - Раус (Raus) индуцировал опухоль, использовав профильтрованный экстракт куриной опухоли, содержащий, как было установлено позже, РНК-вирус (вирус саркомы Рауса). 1913 - Каррель (Carrel) доказал, что в асептических условиях клетки могут расти в культуре в течение длительного времени, если их обеспечить необходимыми питательными веществами. 1948 - Эрл (Earle) и сотрудники установили, что одиночные клетки клеточной линии L в культуре ткани формируют клоны клеток. 1952 - Джей (Gey) и сотрудники получили перевиваемую клеточную линию из карциномы шейки матки; эта клеточная линия широко известна как линия клеток HeLa. 1954 - Леви-Монтальчини (Levi-Montalcini) и сотрудники показали, что в культуре тканей фактор, стимулирующий рост нейронов, вызывает рост аксонов. 1955 - Игл (Eagle) впервые систематически исследовал пищевые потребности клеток в условиях культуры тканей и обнаружил, что клетки животных способны существовать в определенной смеси низкомолекулярных веществ, дополненной не-большим количеством белков сыворотки. 1956 - Пак (Puck) и сотрудники отобрали из культуры клеток HeLa мутантов, потребности которых для роста в культуре резко отличались от потребностей обычных клеток. 1958 - Темин и Рубин (Temin, Rubin) разработали количественный тест инфицирования клеток цыпленка в культуре очищенным вирусом саркомы Рауса. В течение следующего десятилетия Стокер, Дульбекко, Грин (Stoker, Dulbecco, Green) и другие вирусологи установили характеристики вирусной трансформации различных типов. 1961 - Хайфлик и Мурхэд (Hayflick, Moorhead) показали, что в культуре фибробласты человека погибают после определенного числа делений. 1964 - Литтлфилд (Littlefield) впервые использовал для выращивания гибридов соматических клеток селективную среду НАТ. Это нововведение в сочетании с методом гибридизации клеток позволило приступить к изучению генетики соматических клеток. 1964 - Като и Такеуши (Kato, Takeuchi) получили целое растение моркови из растущей в культуре ткани одиночной клетки корня моркови. 1965 - Хэм (Ham) предложил бессывороточную среду определенного химического состава. которая способна поддерживать рост клонов некоторых клеток животных. 1965 - Харрис и Уоткинс (Harris, Watkins) индуцировали вирусом слияние клеток мыши и человека и получили первые гетерокарионы клеток млекопитающих. 1968 - Августи-Точчо и Сато (Augusti-Tocco, Sato) адаптировали к условиям культуры клеток опухоль нервных клеток мыши (нейробластому) и выделили клоны, которые реагировали на раздражение электрическим током и разрастались в нервные волокна. Одновременно получено большое количество других дифференцированных клеточных линий, включая линии скелетных мышц и печени. 1975 - Кёлер и Мильштеин (Kohler, Milstein) получили первые клеточные линии гибридом, секретирующих моноклональные антитела. 1976 - Сато (Sato) и сотрудники опубликовали первую серию статей, в которых было показано, что для роста в бессывороточной среде различным клеточным линиям необходимы различные смеси гормонов и факторов роста. 1981 - Мартин Эванс (Англия) впервые выделил недифференцированные плюрипотентные линии стволовых клеток, полученные из бластоцисты мыши. 1998 - Д. Томпсон и Д. Герхарт выявили бессмертную линию эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). 1999 - журнал Science признал открытие эмбриональных стволовых клеток третьим по значимости событием в биологии после расшифровки двойной спирали ДНК и программы «Геном человека». 2006-2008 – Осаму Симомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсьен открывают и изучают зелёный флуоресцентный белок (GFP)». Разработан метод введения гена GFP в определенные гены животных клеток, позволяющий сделать флуоресцентными собственные белки клетки. Таким образом, дав возможность высококачественного и очень специфического мечения и прижизненного наблюдения за структурными элементами клетки. 2012 - Джон Гёрдон и Синъя Яманака показали возможность перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные.
Работы на культурах клеток удостоенные Нобелевские премии по физиологии или медицине: 1954 Джон Эндерс, Томас Уэллер, Фредерик Роббинс. «За открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей». 1958 Джордж Бидл, Эдуард Тейтем. «За открытия, касающиеся роли генов в специфических биохимических процессах». 1959 Северо Очоа, Артур Корнберг «За открытие механизмов биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот». 1966 Фрэнсис Пейтон Роус «За открытие онкогенных вирусов». 1968 Роберт Холли, Хар Гобинд Корана, Маршалл Ниренберг «За расшифровку генетического кода и его роли в синтезе белков». 1974 Альбер Клод, Кристиан де Дюв, Джордж Паладе «За открытия, касающиеся структурной и функциональной организации клетки». 1975 Дейвид Балтимор, Ренато Дульбекко, Хоуард Темин «За открытия, касающиеся взаимодействия между онкогенными вирусами и генетическим материалом клетки». 1980 Барух Бенасерраф, Жан Доссе, Джордж Снелл «За открытия, касающиеся генетически определенных структур на клеточной поверхности, регулирующих иммунные реакции». 1986 Стэнли Коэн, Рита Леви-Монтальчини «В знак признания открытий, имеющих важнейшее значение для раскрытия механизмов регуляции роста клеток и органов». 1990 Джозеф Марри, Эдуард Донналл Томас «За открытия, касающиеся трансплантации органов и клеток при лечении болезней». 1991 Эрвин Неэр, Берт Закман «За открытия, касающиеся функций одиночных ионных каналов в клетках». 1994 Альфред Гилман, Мартин Родбелл «За открытие G-белков и роли этих белков в передаче сигнала в клетке» 1997 Стенли Прузинер «За открытие прионов, нового биологического принципа инфекции». 2001 Леланд Хартвелл, Тимоти Хант, Пол Нерс «За открытие ключевых регуляторов клеточного цикла». 2002 Сидней Бреннер, Роберт Хорвиц, Джон Салстон «За открытия в области генетического регулирования развития человеческих органов». 2006 Эндрю Файер, Крейг Мелло «За открытие РНК-интерференции — эффекта гашения активности определенных генов». 2007 Марио Капеччи, Мартин Эванс, Оливер Смитис «За открытие принципов введения специфических генных модификаций у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток». 2008 Харальд цур Хаузен, Франсуаза Барре-Синусси, Люк Монтанье «За открытие вируса папилломы человека, вызывающего рак шейки матки» и «За открытие ВИЧ». 2009 Элизабет Блэкбёрн, Кэрол Грейдер, Джек Шостак «За открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы». 2010 Роберт Эдвардс «За технологию искусственного оплодотворения in vitro». 2011 Ральф Стейнман «За открытие дендритных клеток и изучение их значения для приобретённого иммунитета». 2012 - Джону Гёрдону и Синъя Яманака. За «открытие возможности перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные».
__________________________________________________________________ В соответствии с целями и задачами экспериментальной работы можно выделить два направления культивирования животных клеток: – культуры клеток; – культуры органов и тканей (органные культуры).
Свежевыделенные клетки из любой ткани (органа) животного носят название клеток первичной культуры до начала пассирования (пересева или субкультивирования). Клетки первичной культуры обычно гетерогенны. В них наиболее полно представлены типы клеток той ткани, откуда они были получены. Пассирование обеспечивает возможность продления существования культуры, возможность клонирования, исследования и сохранения свойств клеток. При этом получаются более однородные популяции, а также теряются специализированные клетки. Культуру клеток после первого пассирования называют вторичной культурой. Существует два способа получения клеток первичной культуры. Первый – биопсия ткани в стерильных условиях с последующим вымыванием клеток в питательную среду обработкой ткани ферментами (коллагеназой, трипсином) ослабляющими контакт клеток с компонентами внеклеточного матрикса. Второй способ – естественная миграция клеток из прикрепленного ко дну культурального сосуда фрагмента ткани. Первый способ дает больший выход клеток за меньшее время, однако он является селективным способом – не все клетки переживают обработку ткани ферментами.
Культуры клеток также подразделяются по типу ткани-источника (эмбриональная или взрослая), по состоянию ткани на момент забора клеток первичной культуры (нормальные или опухолевые), по подходу к культивированию. Клеточная линия - культура однородных клеток, происходящих чаще всего от одной родительской пары клеток, и обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками. Источники культуры клеток. Культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с соответствующими зрелыми тканями. Причиной этого служит низкий уровень специализации и наличие реплицирующихся клеток-предшественников в эмбрионах. Клетки культуры эмбриональных тканей диплоидны, они сохраняют диплоидный набор хромосом до 50 делений, а затем культура становиться гетероплоидной и способной перевиванию годами. Пролиферативная способность взрослых тканей ниже, они содержат больше неделящихся специализированных клеток. Получение первичных культур клеток взрослых тканей и их размножение является более сложной задачей, продолжительность жизни таких культур, как правило, невелика. Состояние ткани-донора. Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем жизни, тогда как культуры, полученные из опухолей, способны пролиферировать неограниченно долгое время. Дифференцировка нормальных клеток в культуре сопровождается обычно полным прекращением пролиферации клеток. В культурах опухолевых клеток возможна частичная дифференцировка при сохранении способности к пролиферации. Подходы к культивированию животных клеток. Непроточные культуры - тип культур, в котором клетки культивируются в фиксированном объеме питательной среды. По мере роста клеток происходит использование питательных веществ и накопление метаболитов, поэтому среда должна периодически меняться, что приводит к изменению клеточного метаболизма, называемого еще и физиологической дифференцировкой. Со временем, в результате истощения среды происходит прекращение пролиферации клеток. Все системы непроточных культур характеризуются накоплением отходов в той или иной форме и непостоянством внешних условий. Проточные культуры обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменения концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды. Такие системы пригодны для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях. Суспензионные культуры предполагают выращивание клеток во взвешенном состоянии и дают больший выход клеток. В монослойных культурах клетки прикреплены к поверхности культурального сосуда, что дает ряд преимуществ: 1. Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты. 2. Обеспечивается высокая плотность клеток. 3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату. 4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований. 5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов (в биотехнологии), требуются тесные межклеточные контакты. Недостатками монослойных культур являются: - требования большого пространства; - возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба; - недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы; - сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода. Существует три основных способа культивирования клеток в виде монослоя: 1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах, флаконах). 2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 15-20% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе. 3. Культивирование в потоке среды на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные шарики или пластины из различных материалов – декстановые, полистиреновые, стеклянные, целлюлозные носители и др.
|
