Работа № 3. Субкультивирование. Определение жизнеспособности клеток.

Цель работы: Провести пересев клеток первичной культуры фибробластов, полученных в работе №2. Построить кривую роста культуры.

 

!	§ В работе используется только стерильная посуда и расходные материалы. § Операции, описанные в пунктах 1-5 и 7 осуществляются под ламинаром.

 

Протокол работы.

1. Снять клетки с дна культуральной чашки. Для этого заменить весь объем питательной среды из культуральной чашки с монослоем первичной культуры фибробластов на 2-3 мл подогретого до 37⁰С 0.25% раствора трипсина. Помещают чашки в инкубатор.

2. Инкубируют в термостате 15 минут при 37⁰С. Диссоциацию клеток и их открепление от дна чашки можно контролировать, просматривая клетки под микроскопом.

3. По окончании трипсинизации, слегка наклоняют чашку (чтобы жидкость не касалась края чашки!) и пипеткой отбирают получившуюся суспензию клеток в пробирку.

4. Центрифугируют при 500 об.мин 5 минут. Супернатант удаляют, а осадок клеток несколько раз отмывают от раствора трипсина 2 мл культуральной средой Дюльбекко (37⁰С).

5. После отмывки, клетки ресуспендируют в 2 мл культуральной среды.

6. Оценивают количество живых клеток методом прижизненного окрашивания трипановым синим. Для этого из полученной в пункте 5 суспензии клеток, берут аликвоту объемом 10 мкл и добавляют 90 мкл 0,1% раствор трипанового синего. Подготовка гемоцитометра. Шлифованное покровное стекло притирают к предметному стеклу гемоцитометра до появления колец Ньютона, так, чтобы покрыть заштрихованные области. Это приводит к образованию камеры с фиксированным объемом, поскольку края предметного стекла подняты над заштрихованной поверхностью ровно на 0,1 мм. Каждая заштрихованная область состоит из 9 больших квадратов размером 1х1мм, т. е. объем, ограниченный каждым большим квадратом, оказывается равным 1мм х 1мм х 0,1 мм = 0,1 мм³.

Заполняют счетную камеру гемоцитометра окрашенной суспензией клеток за счет капиллярного всасывания, не переполняя каналы камер. Оставляют на несколько минут постоять, чтобы клеткы осели и приняли стабильное положение.

 

Живые клетки не окрашиваются трипановым синим, мертвые – окрашиваются.

 

Подсчет окрашенных (мертвых) клеток. Используется объектив x10. Клетки подсчитываются в 5 больших квадратах 1х1 мм в направлении слева направо сверху вниз (начинают с левого верхнего квадрата, заканчивают средним). Клетки на границе квадратов подсчитывают по правилу – считать клетки только на верхней и левой границах. Клетки подсчитываются в обеих камерах (верхней и нижней). В каждой камере 9 квадратов, подсчитывают в 5 из них, в верхней и нижней камерах. Общее количество квадратов – 10.

 

Среднее количество клеток на квадрат = общее количество клеток в 10 квадратах

количество квадратов (10).

К-во клеток в 1 мл. суспензии = среднее число клеток в квадрате (1x1 мм.) × фактор дилюции × 10 000.

К-во клеток в суспензии = к-во клеток в 1 мл. × общий объём суспензии (в мл.).

 

Решетка цитометра:   Синий квадрат – 0,0025 мм2, 0,25 нл. Желтый квадрат – 0,04 мм2, 4 нл. Зеленый квадрат –0,0625 мм2, 6,25 нл. Красный квадрат - 1 мм2, 100 нл.

Выразить количество живых и мертвых клеток в % от общего количества.

 

7. Суспензию клеток, полученную в пункте 5 переносят в культуральный флакон с вентилируемой крышкой. В флакон предварительно наливают культуральную среду, слоем не более 5 мм. Суспензию клеток стараются распределять по флакону равномерно.

8. Помещают флакон в инкубатор (37 ⁰С, 10% СО₂). Флакон с пересаженными растущими фибробластами просматривают ежесуточно под микроскопом. Через 24-48 часов производят подсчет распластавшихся клеток и замену культуральной среды. Далее каждые 24 часа подсчитывают общее количество клеток в культуре. Обычно через 4-7 суток образуется монослой клеток.

9. На основании полученных данных строят зависимость количества клеток в культуре от времени культивирования.

 

 

В чем принцип метода выявления живых и мертвых клеток при помощи трипанового синего?

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Опишите особенности поведения и метаболической активности клеток в трех фазах кривой роста культуры. Будут ли различаться (если да, то в чем различия) кривые роста нормальных и раковых клеток?

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________