Введение.
Выделение ДНК из культуры клеток эукариот является первым этапом работ, связанных с проведением многих современных методов молекулярной биохимии – полимеразной цепной реакции, рестрикции, гибридизации и др..
Традиционные методы выделения с помощью фенола и хлороформа не подходят для культур клеток, т.к. эти компоненты могут реагировать с культуральным пластиком и не обеспечивают необходимую полноту и чистоту выделения.
В настоящее время существует ряд наборов для выделения как ДНК так и РНК из культур бактериальных и животных клеток, тканей, бактерий, крови, и др.
Современные требования к методу выделения ДНК\РНК из культур животных клеток:
- Полное экстрагирование нуклеиновых кислот из клеток.
- Минимизация потерь и фрагментации при очистке.
- Как можно более высокая степень очистки.
- Не использование токсичных реактивов.
- Процесс выделения ДНК\РНК из пробы должен исключать перекрестную контаминацию (загрязнение пробы) и требует строгой асептики (средств индивидуальной защиты, одноразовых наконечников и пробирок, отдельных автоматических пипеток, ультрафиолетовое облучение рабочего места и всей лаборатории), а также предусматривает оптимальную планировку помещения лаборатории.
В работе используются фибробласты легкого крысы, находящиеся в стационарной фазе роста (монослой) в количестве не менее 5×106.
Для выделения гномной ДНК используется кит-набор для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала «ФБиоНуклео» (ООО “Фрактал Био”, Россия). Принцип действия заключается в селективной сорбции нуклеиновых кислот на силикатной мембране внутри микроцентрифужных колонок-пробирок (spin columns) в растворах с высокой концентрацией хаотропной соли, с последующей элюцией ДНК.
Задача.
Выделить геномную ДНК из культуры фибробластов кожи крысы методом сорбции ДНК.
Протокол работы.
Внимательно ознакомтесь с инструкцией к набору и техникой безопасности.
Состав набора:
- Лизирующий буфер (на основе гуанидинтиоцианата).
- Промывочный буфер
- Буфер для элюции.
- Микроцентрифужные пробирки с вкладышем-колонкой.
- Собирающие пробирки.
| !
| § Все этапы выделения ДНК проводятся в асептических условиях.
§ Для выделения ДНК используются расходные материалы и реактивы, тестированные на отсутствие ДНК-аз.
§ Гуанидинтиоцианат, присутствующий в составе буфера вреден для здоровья - необходимо работать в защитной одежде.
|
- Дважды промыть монослой клеток стерильным фосфатным буфером Дюльбекко (DPBS).
- Соскрести клетки скребком, суспендируя в минимальном объеме, необходимом для центрифугирования DPBS.
- Центрифугировать при 1000 об\мин 5 минут для получения осадка клеток.
- Отобрать в пробирку типа «Эпендорфф» 50 мкл клеток.
- Добавить 100 мл воды культурального качества, тестированной на отсутствие ДНК-аз
- К 100 мкл пробы добавить 800 мкл лизирующего буфера.
Параллельно береться проба на отрицательный контроль – 100 мкл воды.
- Инкубировать микропробирку со смесью 5 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая на вортексе.
- Центрифугировать при 13000 об\мин при комнатной температуре 5 минут для осаждения клеточной мембраны.
- Осторожно, не взбалтывая осадок (!) перенести 800 мкл супернатанта на прилагаемую к набору колонку-вкладыш в центрифужной пробирке. Центрифугировать при 13000 об\мин при комнатной температуре 1 минуту.
- Удалить сток, вытащив вкладыш-колонку из центрифужной микропробирки.
- Поместить колонку назад и нанести на нее 450 мкл промывочного буфера. Центрифугировать при 13000 об\мин при комнатной температуре 1 минуту. Операцию промывки повторить трижды.
- Перенести вкладыш-колонку в собирательную пробирку. Не касаясь наконечником дозатора колонки (!) нанести в ее центр 50 мкл промывочного буфера. Центрифугировать при 13000 об\мин при комнатной температуре 1 минуту. Собрать содержащий ДНК элюат.
- Померять спектрофотометрически абсорбцию выделенной ДНК при двух длинах волн – 260 и 280 нм. Рассчитать соотношение А260/А280. Значение соотношения А260/А280 в пределах 1,8-1,9 свидетельствует о высоком уровне чистоты выделенной ДНК.
