Введение изолированных клеток в культуру. Получение первичной культуры фибробластов легкого и роговицы.

Цель работы: получить первичную культуру фибробластов легкого и роговицы крысы (возраст 2 недели) методом трипсинизации ткани и методом естественной миграции клеток на субстрат. В ходе работы овладеть навыками правильной работы с культуральной посудой и расходными материалами, реактивами.

Протокол работы №1. Получение первичной культуры методом трипсинизации ткани.

1. Подготовить рабочее место.

2. Усыпить животное диэтиловым эфиром.

3. Под ламинаром декапитировать животное, смочить грудную клетку и область глазницы этиловым спиртом, произвести вскрытие грудной клетки и забор биоптата легкого (2х1 см) и глазных яблок. При выполнении операции следует избегать попадание крови на забираемые ткани. В случае необходимости - промыть ткани от крови в стерильном буферном растворе Дюльбекко.

4. Одно глазное яблоко и фрагмент легкого размером 5х5 мм поместить в отдельные пробирки с культуральной средой Дюльбекко. Поместить в термостат на 37 ⁰С. Эти фрагменты ткани будут использоваться для отработки второго метода выделения первичной культуры.

5. Остаток тканей поместить пинцетом ткани в отдельные конические пробирки с 3 мл 0.1% раствором трипсина, нагретого до 37⁰С. Используя ножницы мелко измельчить ткани. Закрыть пробирки крышкой и поставить на инкубацию в термостат при 37⁰С на 15 минут.

5. Отфильтровать через нейлоновую сетку с диаметром пор 20-25 мкм (диаметр фибробластов в суспензии составляет около 10-15 мкм).

6. Отцентрифугировать фильтрат при 500 об.мин в течении 5 минут. При этом клетки и мелкие фрагменты ткани уходят в осадок.

7. Отобрать пипеткой осадок и произвести посев клеток в приготовленные чашки с культуральной средой. Закрыть чашки.

8. Поместить чашки в углекислотный инкубатор (37 ⁰С, 10% СО₂).

9. Через 24 часа пронаблюдать за изменением морфологии клеток при их прикреплении и распластывании по дну чашки. Отделить мелкие фрагменты ткани и неприкрепившиеся клетки заменой питательной среды.

10. В течении недели каждые 24 часа наблюдать за увеличением количества клеток и образованием монослоя. Производить замену питательной среды каждые 48 часов.

1 – клетки в суспензии.   2-3 – распластывание клеток по подложке и рост культуры.