Работа № 4. Криоконсервация клеток. Введение клеток в культуру после заморозки.

Цель работы: Произвести криоконсервацию фибробластов с последующей разморозкой и оценкой их жизнеспособности.

 

!	§ Обязательная защита глаз и рук при работе с жидким азотом. § Операции, описанные в пунктах 1-5 и 7 осуществляются под ламинаром. § В работе используются стерильная посуда и расходные материалы.

 

Протокол работы №1.Заморозка клеток.

 

1.Клетки, полученные в работе №3, снять с дна культуральных флаконов трипсинизацией и отмыть от трипсина, как описано в пунктах 1-4 предыдущей работы.

2.К осадку клеток добавить 1 мл среды Дюльбекко, содержащей 25% фетальной сыворотки (25%FBS-среда). Ресуспендировать клетки.

3. Отобрать аликвоту суспензии клеток и произвести в гемоцитометре подсчет общего количества клеток в без какого либо окрашивания. Рекомендуется для заморозки брать не менее 0.5-1 млн клеток.

4.Отдельно приготовить раствор-криопротектор: 800 мкл 25%FBS-среды+200 мкл 10% ДМСО (в 25%FBS-среде). ДМСО (DMSO, Диметилсульфооксид) используется как криопротектор.

5. К 1мл суспензии клеток в среде добавить 1 мл раствора-криопротектора.

6. Поместить смесь в предварительно охлажденные до +4⁰С криопробирки.

7. Криопробирки поместить в камеру замораживателя. Придерживаться режима охлаждения 2 ⁰С в минуту. По достижении температуры -70⁰С, контейнер с пробирками перемещается в сосуд Дюара с жидким азотом.

 

Протокол работы №2. Размораживание клеток.

 

Примечание: замороженные клетки достаточно хрупкие (плохо переносят пипетирование) и требуют аккуратного обращения. Клетки размораживают быстро и помещают сразу в полную ростовую среду. Если клетки чувствительны к криоконсервантам, их отмывают через центрифугирование, чтобы удалить криоконсервант, и затем делают посев. Так, например, при работе с клетками человека отмывку делают 3 раза.

 

!	§ Обязательная защита глаз и рук при размораживании криопробирок. § Замороженные криопробирки брать только специальным зажимом, а не руками. § С пункта 3 все операции осуществляются под ламинаром. § В работе используются стерильная посуда и расходные материалы.

 

1.Криопробирками достать из азота и выдержать на воздухе 15 минут.

2.Поместить криопробирки на водяную баню (37 ⁰С) до остаточного льда в пробирке 10%. Переместить пробирки в ламинар.

3. Оттаявшую суспензию клеток аккуратно ресуспендировать в 10 мл культуральной среды (37 ⁰С) с последующим центрифугированием 500 об.мин (80 g, 2-3 мин).

4.Полученный осадок клеток ресуспендировать в 2-3 мл среды.

5. Произвести подсчет общего количества, а также живых и мертвых клеток. Выразить жизнеспособность в %.

6. Произвести посев клеток в культуральные флаконы.

 

 

Какой механизм криопротекторного действия ДМСО? __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Почему заморозку и разморозку клеток следует производить со скоростью 1-2 град. цельсия в минуту?

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Почему после размораживания клеток их необходимо отмыть от ДМСО?

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________