Работа № 7. Иммунохимическое изучение структуры цитоскелета клеток.

Цель работы: Произвести окрашивание флуоресцентными антителами к актину актиновых фибрилл цитоскелета фибробластов с нативным (нормальным) и фрагментированным цитоскелетом.

 

Примечание: моноклональные антитела связанные (коньюгированные) с каким либо флуоресцентным красителем позволяют специфически окрашивать тот или иной структурный элемент клетки. Так FITC-коньюгированные антитела к F-актину (где FITC- флюоросцеин изотиоционат, краситель) позволяют визуализировать актиновые фибриллы в клетке, их ориентацию, локализацию и т.д.

Цитохалазин В – модификатор цитоскелета, препятствует образованию в клетках актиновых фибрилл, вследствии чего клетки частично или полностью теряют возможность двигаться по субстрату.

Протокол работы:

!	§ Работа с параформальдегидом проводить только под вытяжкой! § Запрещается касаться блока ртутной лампы флуоресцентного микроскопа руками. § Этапы работы 6-8 проводить в темноте или при слабом красном свете.

 

1. Для работы заранее произвести посев клеток вторичной культуры в две культуральные чашки. На 5-е сутки роста культуры оценивают количество и морфологию клеток, особое внимание обращая на фибробласты с морфологией, свидетельствующей об их движении.

2. За сутки до начала окрашивания (4-е сутки культивирования) в одну из чашек внести цитохалазин В (10 мкг на мл среды) и инкубировать 24 часа (37⁰С, 10% СО₂).

 

3. Снять чашки с инкубации. Удалить культуральную среду, и залить свежеприготовленным 4% раствор параформальдегидом (в 1х PBS pH 7,0). Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.

4. Удалить р-р параформальдегида из чашки и промыть клетки 1х PBS 2-а раза по 2-3 минуты.

5. Смочить препарат клеток раствором БСА-Tween содержащим 3% БСА (бычий сывороточный альбумин) и 0,02% Tween 20 в 1х PBS. Закрыть герметично чашки и инкубировать 30 минут при 37^оС и 95% влажности.

6. Удалить раствор БСА- Tween из чашек и смочить препарат клеток раствором антител (разведенных в растворе БСА- Tween). Закрыть герметично чашки и инкубировать 30 минут при 37^оС и 95% влажности.

7. Произвести отмывку препарата от раствора антител в 3 сменах 0,02% Tween 20 на 1х PBS по 5 мин при 37^оС плавно покачивая чашки.

8. Заключить препарат в фотозащитную среду (5% N-пропилгаллат и 95% нефлуоресцирующего глицерина) и исследовать под микроскопом соблюдая условия флуоресценции: длина волны возбуждения 480 нм, дихроичное зеркало 505 нм. Эмиссия (спектр свечения) коньюгированных с этим красителем антител сосавляет 535 нм (зеленый цвет).

9. Оценить морфологию клеток нормальных, и культивированных с цитохалазином, изменение локализации актина в клетках обеих групп.

 

 

Нормальные фибробласты После инкубации с цитохалазином

 

Какие флуоресцентные красители кроме FITC могут быть конъюгированы с антителами?

Механизм действия цитохалазина на цитоскелет клетки. Какие модификаторы цитоскелета кроме цитохалазина еще существуют?

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________