Работа № 9. Разделение молекул ДНК по молекулярной массе методом электрофореза.

Введение.

Для анализа спектра молекулярной массы выделенной ДНК, для анализа результата действия рестриктаз на ДНК, а также для оценки проведения полимеразной цепной реакции используют метод электрофореза. Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза. ДНК помещают в гель (обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением), который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду (аноду), причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров (смесей фрагментов ДНК известных длин – лунка №1 на рис.) можно установить длину молекул в образце.

Визуализовать результаты фореза можно двумя способами. Первый, наиболее часто используемый в последнее время — добавление в гель веществ, флуоресцирующих в присутствии ДНК (традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества). Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков (рис. 4). Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения (этот метод визуализации называют авторадиографией).

Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем (обычно полиакриламидным). Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид.

Задача.

Провести разделение по молекулярной массе выделенной в работе №3 ДНК из культуры фибробластов методом электрофореза в агарозном геле.

Протокол работы.

Перед проведением собственно электрофореза, необходимо приготовить следующие растворы:

1. Концентрированный буфер для электрофореза (50x, pH 8,5): 242 г Трис, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0.5M EDTA. Довести водой до 1 литра.
2. Раствор красителя Cresol red: 50mM в H₂O.
3. Буфер для нанесения: 0,25 мл 0,5% лаурилсульфата натрия (SDS), 1 мл 0,1М EDTA (pH 8,0), 2,5 мл 50% глицерола, 1,25 мл воды (общий объем 5 мл). Добавить раствор красителя Cresol red до конечной его концентрации 0.1mM.
4. Приготовить гель для электрофореза. Готовят 1% агарозный гель в 1 х буфере для электрофореза и охлаждают его до 70 ⁰С. Для инактивации РНКаз добавляют в гель сухой йодацетат натрия до конечной концентрации 10 мМ. Охлаждают смесь до примерно 50 ⁰С, выливают в кювету для электрофореза (слой толщиной 3 мм) и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. После застывания геля, заливают камеру буфером для электрофореза.Во избежание повреждения геля не лить буфер на гель и вытаскивать гребенку только когда буфер будет налит.

Этапы работы:

1. Образец (примерно 20 мкг) двухцепочечной ДНК растворяют в 3 мкл воды, тестированной на ДНК-азы (или берут 3-5 мкл жидкого ДНК-содержащего образца).
2. Денатурируют ДНК прогреванием при 100 °С в течение 1 минуты.
3. Добавляют к каждому образцу ДНК 2,5 мкл буфера для нанесения, осторожно перемешивают.
4. Вносят образцы в лунки агарозного геля и проводят электрофорез при градиенте напряженности 2 В/см в 1 х буфере для электрофореза. Во время электрофореза должна быть обеспечена рециркуляция буфера, чтобы его рН поддерживался на уровне рН 8,5.
5. Когда Cresol red дойдет до конца геля, электрофорез останавливают и окрашивают гель бромистым этидием (0,5 мкг/мл в 25 мМ трис-HCl, рН 9,0) в течение 1 ч при осторожном покачивании. При сильном фоновом окрашивании лишний бромистый этидий можно отмыть водой (две смены по 30 мин каждая).
6. Просматривают гель в УФ-трансиллюминаторе и фотографируют его.