Работа № 5. Окрашивание ядер и лизосом нормальных и апоптических фибробластов акридиновым оранжевым.

Цели работы: Оценить жизнеспособность фибробластов, растущих в атмосфере с 10% CО₂ и среде без углекислого газа методом окрашивания их ядер и лизосом акридиновым оранжевым.

Протокол работы №1. Окраска ядер фиксированных клеток акридиновым оранжевым.

Примечание: Для нормального функционирования фибробластов необходимо наличие СО2 в атмосфере культивирования. Культивирование клеток в отсутствии углекислого газа в среде приводит к замедлению роста культуры, увеличению апоптических клеток в культуре и ее гибели. Акридиновый оранжевый – флуорохроматический краситель, который связывается с нуклеиновыми кислотами клеток. Под действием света длиной волны 430 нм в нормальных клетках ядра окрашиваются в зелёный цвет, а в апоптотических в оранжево-красный. Принцип такой дифференциальной окраски - молекулы акридинового оранжевого по-разному взаимодействуют с однонитевыми и двунитевыми молекулами РНК и ДНК. Окрашенные двунитевые молекулы нуклеиновых кислот флуоресцируют зеленым светом, а однонитевые – красным. В некоторых апоптоических клетках, даже можно увидеть фрагментацию ядра. Перед покраской образцы необходимо обработать РНКазой (РНК также окрашивается этим красителем в оранжевый-красный цвет).

!	§ Краситель акридиновый оранжевый - канцероген! § Работы с метиловым спиртом и параформальдегидом проводить только под вытяжкой! § Запрещается касаться блока ртутной лампы флуоресцентного микроскопа руками.

 

1. Для работы предварительно произвести посев вторичной культуры фибробластов в культуральные чашки и поместить в СО2-инкубатор с 10% углекислого газа. Через 3-4 суток произвести замену культуральной среды, а одной и групп отключить подачу СО2. Через 4 суток инкубации в различных условиях производят окрашивание ядер клеток и оценку их состояния в культуре.

2. Приготовить концентрированный раствор акридинового оранжевого: 1 мг красителя на 1 мл бидистиллированной воды (может храниться в темноте при 4^оС).

3. Из культуральных чашек с клетками удалить культуральную среду, и залить свежеприготовленным 4% раствор параформальдегидом (в 1х PBS pH 7,0). Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.

4. Удалить параформальдегид и промыть два раза (выдержка 5 мин) ацетатным буфером (pH 4,2).

5. Залить фиксированные клетки на 15 мин свежеприготовленным рабочим раствором акридинового оранжевого (1 часть концентрированного раствора на 9 частей ацетатного буфера (pH 4,2)).

6. Удалить краситель и промыть в 2 сменах ацетатного буфера (pH 4,2) по 2 мин. Дать высохнуть препаратам в потоке воздуха комнатной температуры без доступа света.

7. Произвести флуоресцентное микроскопирование препаратов. Условия флуоресценции: длина волны возбуждения – 430 нм, отсекающий фильтр- 515 нм.

Оценить морфологию ядер клеток растущих в условиях нормальной для их роста атмосферы (10% CO₂) и в отсутствии углекислого газа.

 

 

Нормальная клетка Ранний апоптоз Поздний апоптоз Некроз

 

Протокол работы №2. Прижизненная окраска лизосом нормальных и апоптических клеток акридиновым оранжевым.

!	§ Краситель акридиновый оранжевый - канцероген! § Запрещается касаться блока ртутной лампы флуоресцентного микроскопа руками.

1. Для работы предварительно произвести посев вторичной культуры фибробластов в культуральные чашки и поместить в СО2-инкубатор с 10% углекислого газа. Через 3-4 суток произвести замену культуральной среды, а одной и групп отключить подачу СО2. Через 4 суток инкубации в различных условиях производят окрашивание лизосом клеток и оценку их состояния в культуре.

1. Приготовить концентрированный раствор акридинового оранжевого – 1 мг красителя в 2 мл буфера Макильвейна (McIlwaine’s buffer), pH 7,3.

 

Приготовление буфера Макильвейна: смешать 18,17 мл 0,2 М Na₂HPO₄ и 1,83 мл лимонной кислоты (конечный объем 20 мл). Полученный буферный раствор должен иметь рН 7,4. Довести рН буфера до 7,3 минимальным количеством HCl. Профильтровать полученный раствор через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.

 

2. Приготовить рабочий раствор акридинового оранжевого – 0,1 мл концентрированного раствора развести в 9,9 мл буфера.

3. Промыть клетки от культуральной среды PBS-буфером Дюльбекко.

4. Инкубировать клетки 5 мин в свежеприготовленном рабочем растворе красителя (37⁰С, 10 % СО₂).

5. Отмыть клетки от красителя (пару раз по несколько секунд) буфером Макильвейна, заключить препарат в том же буфере и исследовать под микроскопом. Лизосомы живых клеток флуоресцируют оранжевым цветом (А). Мертвые клетки имеют ярко-красную флуоресценцию цитоплазмы и ярко-зеленую ядер (Б).

 

В чем принцип дифференциальной окраски ДНК акридиновым оранжевым? Завсисит ли спектр флуоресценции этого красителя от pH (если да, то как)? Какие еще ДНК-специфичные флуоресцентные красители существуют?

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________