Проведение анализа. Диск бумаги следует держать за края, чтобы избежать появления отпечатков пальцев на хроматограмме
Диск бумаги следует держать за края, чтобы избежать появления отпечатков пальцев на хроматограмме. Диск специальной хроматографической бумаги карандашом делят на 4 сектора и обозначают их согласно исходным растворам. На расстоянии 1, 0 см от центра карандашом отмечают круговую линию старта. В центре листа хроматографической бумаги делают отверстие диаметром около 0, 2 см и вставляют фитиль из скрученной полоски бумаги. Высота фитиля должна быть равна высоте чашки Петри. Стеклянными капиллярами на линию старта в секторах 1, 2, 3 наносят соответствующие растворы аминокислот-свидетелей и в сектор 4 – исследуемую смесь аминокислот. Просушивают хроматограммы на воздухе до исчезновения влажных пятен. Хроматограмму помещают в заранее приготовленную чашку Петри (хроматографическую камеру), на 1/3 заполненную хроматографической смесью. Разделение проводят в закрытой чашке Петри, чтобы избежать испарения растворителя, при комнатной температуре под визуальным контролем (в течение 15‑ 30 минут). Когда фронт растворителя достигнет границ бумажного диска, разделение прекращают. Немедленно (!) карандашом обводят по всей окружности линию фронта растворителя. Хроматограмму высушивают при температуре 90‑ 100°С с целью устранения растворителей и фиксации аминокислот. Далее хроматограмму опрыскивают раствором нингидрина, вновь выдерживают при 100°С. На бумаге проявляются красноватые, пурпурно-красные, в большинстве случаев сине-фиолетовые пятна, соответствующие расположению различных аминокислот.
Рассчитывают коэффициент распределения Rf для каждой аминокислоты: Rf = а – расстояние, пройденное от линии старта аминокислотой (мм), Идентифицируют аминокислоты, находящиеся в исследуемом растворе (сектор 4), путем сравнения их положения (коэффициент Rf) с положением соответствующих аминокислот, используемых в качестве " свидетелей" (сектора 1, 2, 3).
|
, где
