МАЗКОВ КРОВИ

Цель занятия. Освоить методику подготовки предметных стекол; приобрести навыки по приготовлению, фиксации и окраске мазков крови.

Объекты исследования и оборудование. Стабилизированная кровь.

Стекла предметные и шлифованные, приборы для массовой окраски мазков, выпаривательные чашки, стеклянные рамки, глазные пипетки, метанол, этанол, смесь этанола с этиловым эфиром, гематоксилин, 1%-й раствор гидрокарбоната натрия, 1%-й раствор уксусной кислоты, фабричные растворы краски Романовс­кого—Гимзы и Май-Грюнвальда, дистиллированная вода.

Приготовление мазков крови. Наилучшие мазки получаются из свежевзятой (нативной) крови, поэтому их надо готовить сразу же, пока клетки не претерпели существенных изменений. Из крови, стабилизированной цитратом или оксалатом натрия, мазки можно приготовить в течение 6 ч после ее взятия, из гепаринизирован-ной — в течение 24 ч. Обычно для мазков используют предвари­тельно подготовленные предметные стекла.

Подготовка предметных стекол. Новые, не бывшие в употреб­лении стекла промывают в водопроводной воде, затем в дистил­лированной, высушивают и закладывают в банку с притертой крышкой, содержащую смесь (1: 1) этилового эфира и этилово­го спирта (смесь Никифорова). Перед работой стекла извлека­ют пинцетом и протирают чистой сухой полотняной тряпкой. Подготовленные стекла можно хранить, сложив в пакеты по 10...20 шт. и завернув в бумагу.

Стекла, бывшие в употреблении, очищают от кедрового мас­ла: протирают тряпкой, смоченной бензином или ксилолом, и моют щеткой в теплой мыльной воде. Помещают на 24 ч в хро­мовую смесь (к 5 л серной кислоты прибавляют при помеши­вании 500, 0 г бихромата калия, растертого до состояния мел­кого порошка) или выдерживают 12 ч в 1...2%-м растворе бикар­боната натрия (едкой щелочи или стирального порошка) с пос­ледующим кипячением в том же растворе в течение 5... 10 мин. После этого стекла моют 2 ч в проточной водопроводной воде, ополаскивают 4...6 раз дистиллированной водой, просушивают в сушильном шкафу или термостате и закладывают на хранение в смесь Никифорова.

 

Рис. 7.9. Приготовление маз­ка крови

Техника приготовления мазка. Пред­метное стекло зажимают между боль­шим и указательным пальцами левой руки (рис. 7.9). Отступя 1 см от края стекла, ближе к указательному пальцу, наносят каплю крови диаметром 2...3 мм. Это делают следующим образом: прика­саются поверхностью предметного стек­ла к капле крови, выступившей после прокола кожи, либо используют глазную или пастеровскую пипетку. Можно на­нести каплю краем пробки, закрывающей пробирку. Затем правой рукой устанавливают вблизи от капли шлифованное стекло под углом 30...45" и осторожно продвигают до соприкосновения его края с каплей крови. С помощью коротких боковых движений распределяют кровь вдоль всего ребра шлифованного стекла, ко­торое плавно продвигают справа налево по предметному.

Хороший мазок должен быть совершенно ровным (без переры­вов, пустот), однородным, достаточно длинным, но не доходить до краев стекла, оканчиваясь в виде бахромы и, кроме того, уже предметного стекла (рис. 7.10).

Мазки крови лучше готовить на подогретых предметных стек­лах, для чего используют резиновые грелки с теплой водой (45...50°С), электрообогревательный столик микроскопа или стери­лизатор с горячей водой, который закрывают крышкой; на этих же приспособлениях мазки высушивают.

В холодное время необходимо предупреждать конденсацию па­ров воды на мазках крови (вода может вызвать гемолиз).

На высушенном мазке в начальной его части простым каранда­шом или иглой от шприца указывают номер животного и дату взя­тия крови.

ЙЙЙЙЙЯ

 

Т

 

Рис. 7.10. Мазки крови:

1 — приготовленный на плохо обезжиренном стекле; 2— короткий; 3 — неравномерный; 4 — толстый; 5—правильно приготовленный

Фиксация мазков. Мазки крови в течение 2 дней после изготов­ления необходимо или зафиксировать, или окрасить, так'как клет­ки крови на нефиксированных мазках уже через 1 мес хранения теряют способность правильно воспринимать окраску.

Для фиксации можно использовать метиловый спирт (5 мин), 95%-й этиловый спирт (30 мин), смесь (1: 1) этилового спирта и этилового эфира (30 мин), денатурированный спирт (30 мин), пары формалина (30 мин) и др. Мазки помещают в кюветы или ванночки с соответствующим фиксатором и закрывают крышкой, следя за тем, чтобы мазки не соприкасались друг с другом. После фиксации мазки высушивают на воздухе или в термостате.

Окраска мазков. Качество окраски мазков зависит от многих факторов, в том числе и от рН воды, применяемой для разведения красителей.

У дистиллированной воды, используемой в лабораториях, чаще бывает кислая реакция. Для нейтрализации в воду по каплям добавляют 1%-й раствор гидрокарбоната натрия. Для воды с ще­лочной реакцией используют 1%-й раствор уксусной кислоты. рН контролируют с помощью рН-метра или гематоксилина. При добавлении к воде нескольких крупинок гематоксилина появляет­ся розово-фиолетовое окрашивание. По времени его появления судят о реакции воды: в течение 1...5 мин —нейтральная, через 5 мин — кислая, раньше 1 мин — щелочная.

В гематологии разработано большое число методов окраски мазков крови. Выбор метода зависит от цели исследования. Чаще используют следующие методы окраски.

Метод Романовского—Гимзы. Предварительно фиксированные препараты укладывают мазком вниз на стеклянный мостик в кю­вете и наливают под них рабочий раствор краски (фабричный раствор краски Романовского—Гимзы разбавляют дистиллиро­ванной водой из расчета 2 капли краски на 1 мл воды). Время ок­рашивания составляет 15...30 мин в зависимости от температуры в помещении (чем она ниже, тем дольше нужно окрашивать) и ка­чества красителя. В заключение мазок промывают дистиллирован-і юй водой и высушивают.

При использовании нового флакона нужно подбирать опти­мальное разведение краски и время окрашивания. Для массовой окраски мазков применяют специальные наборы.

Хорошо окрашенные мазки розово-фиолетового цвета, недо-крашенные — розово-красноватые, а перекрашенные — темно-фио­летовые.

Метод Филипсона. На нефиксированный мазок наносят 20 ка­пель спиртового раствора краски (фабричный раствор краски Романовского—Гимзы разбавляют 96%-м этанолом в соотноше­нии 1: 4). Через 5 мин к краске на мазке добавляют 20 капель дистиллированной воды. Мазки через 17...20 мин промывают во­допроводной водой и затем высушивают.

 

Метод Паппенгеима. На нефиксированный мазок наносят 20 капель фабричного раствора краски Май—Грюнвальда, к кото­рой через 3 мин добавляют 20 капель дистиллированной воды, размешивая стеклянной палочкой или глазной пипеткой. Спустя 1 мин краску с мазка удаляют, препарат кладут на стеклянный мостик мазком вниз и наливают под него рабочий раствор краски Романовского—Гимзы. Через 10... 15 мин препарат промывают во­дой и высушивают.