Задание 2. Определение общего количества грибов

Объект исследования: готовые ЛФ (растворы для перорального применения, таблетки, порошки, мази, пасты). Цельные или разведенные 1: 10 образцы ЛФ засевают по 0, 5 мл на плотную среду Сабуро. Посевы инкубируют при 24º С в течение 5 суток, затем подсчитывают число выросших колоний и определяют количество грибов в 1 мл или 1 г препарата.

Контрольные ВОПРОСЫ

1. Каковы критерии безопасности пищевых продуктов?

2. Какие микробиологические показатели определяют при анализе санитарно-эпидемической безопасности продуктов питания?

3. Какие микроорганизмы являются санитарно-показательными для большинства пищевых продуктов?

4. Перечислите методы выявления в продуктах питания бактерий группы кишечной палочки.

5. Какие лекарственные формы должны быть стерильными?

6. Какое количество микроорганизмов максимально допустимо в лекарственных формах для перорального применения?

7. Какие показатели определяют при бактериологическом анализе лекарственных форм?

РАЗДЕЛ 5. ПРИКЛАДНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

5.1. Методы оценки иммунного статуса человека

Цель занятия

Знакомство с методами оценки иммунного статуса человека.

Основные сведения

Оценка иммунного статуса включает количественную и качественную оценку основных факторов неспецифической защиты и основных звеньев иммунной системы: Т-лимфоцитов и их главных конечных продуктов – цитокинов; В-лимфоцитов и их главных конечных продуктов – иммуноглобулинов. Оценку иммунного статуса проводят в несколько этапов:

1. клинический анализ крови, который дает информацию о количестве циркулирующих в крови гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов;

2. оценка активности неспецифических факторов иммунитета (макрофагально-фагоцитарного звена иммунитета, системы комплемента, естественных киллеров, системы интерферонов);

3. дифференцировка лимфоцитов на кластеры дифференциации по поверхностным CD-маркерам;

4. анализ функциональной активности Т- и В-лимфоцитов;

5. определение концентрации иммуноглобулинов четырех основных изотипов.

Методы оценки неспецифической защиты организма

При оценке активности неспецифических факторов иммунитета используют несколько методов, направленных на:

- анализ активности макрофагально-фагоцитарного звена по показателям фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа, показателю авершеного фагоцитоза, интенсивности окислительного взрыва в фагоцитах (НСТ-тест);

- определение количественного содержания комплемента в крови методом титрования;

- определение количества пропердина по степени сорбции комплемента на комплексе зимозан-пропердин;

- определение количественного содержания лизоцима методом титрования или фотометрически по уменьшению оптической плотности суспензии микрококка;

- определение бактерицидной активности сыворотки.

1. Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов.

Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови к цитратной крови, взятой из пальца или локтевой вены, добавляют взвесь инактивированной микробной культуры с концентрацией 2 млрд микробов в 1 мл. Смесь инкубируют 30 минут при 37º С, центрифугируют при 1500 об/мин, удаляют надоосадочный слой, с помощью пипетки Пастера осторожно отсасывают серебристый слой лейкоцитов, готовят мазки, фиксируют спирто-эфирной смесью, красят по Романовскому-Гимзе и микроскопируют. Подсчет фагоцитированных микробных клеток ведут в 200 нейтрофилах (50 моноцитах), рассчитывают фагоцитарный индекс (процент фагоцитирующих лейкоцитов) и фагоцитарное число (среднее число микробов, поглощенных одним активным фагоцитом). Полученные данные сравнивают с нормами (табл. 6).

2. НСТ-тест

В качестве косвенного показателя бактерицидности фагоцитирующих клеток оценивают интенсивность окислительного взрыва в фагоцитах по способности восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме клеток осадка темно-синео формазана (учитывают долю формазан-положительных клеток в процентах). При инкубации лейкоцитов здоровых людей только с красителем доля формазан-положительных клеток обычно не превышает 1–2 %, в присутствии индукторов окислительного взрыва (клеток микроорганизмов, бактериальных липополисахаридов и др.) может достигать 100 %. Снижение доли формазан-положительных клеток свидетельствует о дефектности кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов.

Таблица 6

Интенсивность реакции фагоцитоза для человека в норме
(нейтрофилы)

Показатели	Дети	Взрослые
Фагоцитарный индекс, %		75–80
Фагоцитарное число		14–15
Показатель завершенности фагоцитоза, %		55–60
НСТ-тест (индекс активности нейтрофилов)	0, 1–0, 15	0, 1–0, 15

3. Титрование комплемента.

Для определения титра комплемента исследуемую сыворотку разводят и добавляют гемолитическую систему (смесь равных объемов эритроцитов барана и гемолитической сыворотки). Пробирки инкубируют при 37º С 30 минут, встряхивая каждые 10 минут. Для контроля готовят разведения эритроцитов и дисиллированной воды: 0, 1 мл + 2, 9 мл (соответствует 20 % гемолизу), 0, 25 мл + 2, 75 мл (соответствует 50 % гемолизу), 0, 35 мл + 2, 65 мл (соответствует 70 % гемолизу).Затем содержимое пробирки центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 минут и определяют пробирку, соответствующую 50 % гемолизу. Количество комплемента, внесенное в эту пробирку, делят на исходное разведение и узнают, какое количество неразведенной сыворотки дает этот феномен. Полученная величина будет соответствовать 1 единице СН₅₀. Вычисляют, сколько таких единиц будет в 1 мл неразведенной сыворотки (схема титрования комплемента приведена в приложении).Показатели основных гуморальных факторов иммунитета здоровых людей приведены в таблице 7.

4. Определение количества пропердина.

Опыт ставится в двух пробирках. Опытная содержит испытуемую сыворотку, зимозан и комплемент, контрольная – только испытуемую сыворотку и комплемент. Пробирки инкубируют при 37º С 60 минут. Далее в обеих пробирках по общепринятой методике титрую комплемент. Титр комплемента в контрольной пробирке показывает, какое количество комплемента было в опытной пробирке до образования комплекса пропердин-зимозан. Титрование же комплемента в опытной пробирке показывает какое количество осталось несвязанным после образования этого комплекса. По разнице полученных единиц можно судить о количестве комплемента, связанного комплексом пропердин-зимозан. За 1 единицу пропердина принимается его количество, которое полностью связывает весь комплемент в 1 мл сыворотки.

Таблица 7