Задание 2. Оценка завершенности фагоцитоза по методу В. М. Бермана и Е. М. Славской

Объект исследования – образец крови. В центрифужную пробирку с 5–10 мл оксалата натрия и 0, 5–1 мл крови добавляют взвесь микроорганизмов и помещают в термостат при 37º С на 30 минут. Затем несколько капель взвеси наносят в чашку Петри на подсушенный 2 % питательный агар, втирают в поверхность агара стерильным шпателем и термостатируют при 37º С (время инкубации устанавливают экспериментально). Затем готовят мазки-отпечатки, фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Считают показатель завершенного фагоцитоза (процент клеток с завершенным фагоцитозом на 100 просмотренных нейтрофилов).

Контрольные ВОПРОСЫ

1. С какой целью определяют иммунный статус пациента?

2. Какими методами определяют активность макрофагально-фагоци­тарного звена иммунитета?

3. С какой целью при определении активности фагоцитоза к исследуемой пробе крови добавляют взвесь микроорганизмов или латекс?

4. Какую информацию дают результаты НСТ-теста?

5. Какие признаки позволяют дифференцировать лимфоциты на кластеры?

6. С какой целью используется РБТЛ?

5.2.Методы оценки иммунного ответа

Цель занятия

Знакомство с методами оценки иммунного ответа.

Основные сведения

Иммунный ответ на инфекцию или иммунизацию вакцинными препаратами позволяет оценить функциональную активность иммунной системы в целом. Часто выявление той или иной формы специфического иммунного ответа на конкретный антиген позволяет ускорить диагностику заболевания. Оценку иммунного ответ проводят в двух направлениях:

- оценка гуморального иммунного ответа;

- оценка клеточного иммунного ответа.

1. Оценка гуморального иммунного ответа основана на выявлении и определении титра специфических антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях. Наиболее информативным является определение титра антител в динамике инфекционного заболевания, так как именно нарастание титра антител свидетельствует о текущей инфекции. Диагностическое значение имеет определение принадлежности специфических антител к тому или ному изотипу иммуноглобулинов: для первичной инфекции наиболее характерно накопление антител изотипа IgM, а рецидив инфекции сопровождается преобладанием антител изотипа IgG.

а) Выявление нарастания титра антител в серологических реакциях с парными сыворотками больного. Сыворотки получают от одного и того же пациента в динамике инфекционного или вакцинального процесса (например, на 1-ой и на 3–4 неделе). Затем ставят реакции агглютинации, РНГА и РСК (при бактериальных инфекциях и вакцинации бактериальными вакцинами); РСК, РТГА и реакцию нейтрализации (при вирусных инфекциях и вакцинации вирусными вакцинами). Нарастание титра антитоксических антител оценивают с помощью реакции флоккуляции или нейтрализации токсинов. Диагностическое значение имеет 4-кратное и более увеличение титра антител.

б) Дифференцировку IgM и IgG проводят обычно с помощью РСК или РТГА. Метод основан на различной чувствительности иммуноглобулинов этих изотипов к действию 2-меркаптоэтанола, цистеина и других редуцирующих веществ, которые вызывают разрывы дисульфитных связей в молекулах IgM и их распад на субъединицы, лишенные антительной активности. При действии этих же веществ молекулы IgG сохраняют свою целостность и антительную активность. При дифференцировке IgM и IgG ставят серологическую реакция (РСК или РТГА) с двумя порциями сыворотки одного пациента: с нативной и обработанной 2-меркаптоэта­нолом. Снижение титра специфических антител в исследуемой сыворотке в результате обработки 2-меркаптоэтанолом свидетельствует о первичном иммунном ответе. Дифференцировку IgM и IgG можно проводить и методом ИФА.

2. Клеточно-опосредованный иммунный ответ оценивается выявлением специфической сенсибилизации Т-лимфоцитов (с помощью кожно-аллергических проб) и с помощью реакции торможения миграции лейкоцитов:

а) Кожно-аллергическая проба. В основе положительной кожной пробы лежит клеточная реакция гиперчувствительности замедленного типа. При внутрикожном введении небольшого количества антигена (туберкулина при туберкулезе, бруцеллина при бруцеллезе) в положительном случае наблюдается покраснение, припухание и уплотнение (инфильтрат) на месте введения через 24–48 часов. Положительная реакция свидетельствует о текущем или прошлом инфицировании микроорганизмом, которое привело к формированию в организме клона Т-лимфоцитов, способных распознавать его антигены и активироваться. Положительная кожная проба может быть и результатом эффективной вакцинации против соответствующей инфекции.

б) Реакция торможения миграции лейкоцитов. В основе метода лежит способность лимфоцитов после повторного контакта с анигеном, к которому они ранее были сенсибилизированы, продуцировать различные лимфокины, в том числе влияющие на миграцию индикаторных клеток (гранулоцитов, моноцитов, макрофагов). Реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) ставят в капиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейкоцитов крови в присутствии и в отсутствие причинного микробного агента, после чего измеряют зоны миграции (в %) в присутствии антигена по сравнению с контролем (принятым за 100 %). В случае выявления сенсибилизации к антигену наблюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже 100 %).

Содержание лабораторной работы