Показатели основных гуморальных факторов иммунитета здоровых людей
Дифференцировка лимфоцитов на кластеры дифференциации Изучение лимфоцитов начинается с их выделения из крови. Мононуклеарные лейкоциты (лимфоциты, моноциты) отделяют от других клеток крови (гранулоцитов и эритроцитов) центрифугированием в градиенте плотности специальной смеси препаратов (фикол, верографин). Имеющие большую плотность эритроциты и гранулоциты образуют осадок на дне пробирки, а мононуклеарные клетки образуют кольцо на поверхности градиентной смеси, откуда могут быть перенесены в отдельную пробирку и отмыты от градиентной смеси. Дифференцировка популяций и субпопуляций лимфоцитов связана с выявлением поверхностных CD-маркеров – антигенов (табл. 8) с помощью соответствующих специфических антител. Определение количества лимфоцитов разных популяций (субпопуляций) по поверхностным маркерам проводится с помощью двух методик: - люминесцентной или световой микроскопии мазков крови или взвеси мононуклеаров, обработанных соответствующими моноклональными антителами, меченными флюорохромом или ферментом (для одного образца занимает неделю); - автоматического подсчета клеток с использованием проточного цитофлюориметра (для одного образца занимает несколько часов). Таблица 8 Количественное содержание лейкоцитов в циркулирующей
Анализ функциональной активности Т- и В-лимфоцитов 1. Функциональную полноценность Т-лимфоцитов косвенно оценивают с помощью кожно-аллергической пробы, отражающей интенсивность реакций ГЗТ в отношении наиболее микробных антигенов (стрептококковых, туберкулина, дифтерийного анатоксина). Антиген вводят внутрикожно и через 48 часов измеряют диаметр инфильтрата – уплотнения, отражающий интенсивность реакции ГЗТ. 2. Для количественной оценки пролиферации Т- и В-лимфоцитов в ответ на распознавание конкретного антигена оценивают пролиферативную активность клеток в реакции бласттрансформации лимфоцитов. Взвесь лимфоцитов обрабатывают поликлональным митогеном (Т-лимфоциты – препаратом из растений семейства Бобовые, В-лимфоциты – компонентами бактерий), инкубируют и добавляют 3Н-тимидин. Через 2–3 суток инкубации измеряют включенную клетками радиоактивность (3Н-тимидин включается в ДНК клеток при их активной пролиферации). 3. Функции Т-лимфоцитов оценивают по их способности продуцировать цитокины. Для этого после активации культуры Т-лимфоцитов определяют типы цитокинов и их количество в культуральной среде. Количество цитокинов определяют по их биологической активности или выявляют как антигены с помощью специфических МКАТ и ИФА. 4. Функции В-лимфоцитов косвенно оценивают по уровням иммуноглобулинов и изогемагглютининов в сыворотке крови. Определение концентрации иммуноглобулинов четырех Содержание в сыворотке крови иммуноглобулинов четырех основных изотипов (IgG, IgM, IgA, IgE) определяют, пользуясь наборами специфических антисывороток или МКАТ, полученных против изотип-специфических антигенов этих иммуноглобулинов. Для определения количественного содержания иммуноглобулинов разных изотипов в биологических жидкостях используют радиальную иммунодиффузию (по Манчини), твердофазный ИФА или РИА, метод иммунотурбидометрии. Радиальная иммунодиффузия по Манчини. В геле, содержащем специфическую антиглобулиновую антисыворотку, делают лунки, которые заполняют исследуемыми сыворотками. Из лунок молекулы иммуноглобулинов диффундирую в гель и образуют кольца преципитации с соответствующими антииммуноглобулиновыми антителами. Количественное содержание иммуноглобулинов устанавливают по диаметру колец преципитации. Содержание лабораторной работы
|
