Определение активности альфа-амилазы и липазы в сыворотке крови. Клинико-диагностическое значение

Альфа-амилаза (диастаза, альфа-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза) – фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов (крахмала, гликогена, амилозы и других продуктов, содержащих 3 и более остатка Glc) до декстринов и мальтозы. Процесс распада полисахаридов, происходящий по месту альфа-1,4-глюкозидных связей, включает в себя ряд стадий: крахмал→ эритродекстрины→ ахродекстрины→ альтотетроза→ мальтоза→Glc.

Наиболее богаты этим ферментом ПЖ и слюнные железы, хотя высокую амилолитическую акт-сть проявляют также фаллопиевые трубы, киш-к, печень, почки, легкие, жировая ткань. Ур-нь α-амилазы в крови во многом зависит от функц-ного состояния печени. В крови 2 изоэнзима: панкреатический (Р) – 3 изоформы – и слюнной (S) – 7 изоформ. Изоамилазы слюны - 2 семейства, отдельные представители ктр отличаются молекулярной массой и электрофоретической подвижностью. Считают, что амилолитическую активность плазмы крови практ-ки здоровых людей составляют 2 изоамилазы Р-типа и 3 S-типа. Третий тип альфа-амилазы – макроамилаза – образует комплекс с Ig-ми и не проходит ч/з почеч. фильтр, обуславливая в отдельных случаях постоянно повышенную фермент-ную акт-сть сыв-ки (плазмы) крови.

С мочой выдел-ся в основном Р-амилаза и это обусл-ет большую информат-сть опр-ния акт-сти α-амилазы в моче как теста оценки функционального состояния ПЖ. Полагают, что 65% амилазной активности мочи обусловлено панкреатической амилазой, в то время как 60% амилолитической активности сыв-ки обеспечивается амилазой сл/ж. Этим и объясняется то обстоятельство, что при о. панкреатите именно Р-амилаза ↑ свою акт-сть в сыв-ке крови (до 89%) и особенно в моче (92%) без изм-ний показателей акт-сти амилазы сл/ж в этих биол-ких жидкостях. У практически здоровых людей содержание сл. и панкр амилазы в крови ≈, в моче же ур-нь панкреатической амилазы в 2 раза выше.

Фермент связан с белками плазмы крови и с форменными ее элементами. Возможно, это является формой депонирования и транспорта энзима.

Методы изучения активности α-амилазы в биожидкостях (сыв-ке, моче, поте) делятся ан 2 основные группы:

1. Сахарирующие, основанные на исследовании образующихся из крахмала сахаров по редуцирующему действию Glc и мальтозы.

2.Амилокластические, базирующиеся на опр-нии остатка нерасщепленного крахмала по ст-ни интенсивности его реакции с йодом. Для оценки объема расщ-ия крахмального субстрата используют турбидиметрический, йодометрический (избыток негидролизованного субстрата+йод= окраш-ое соед) или нефелометрический способ его определения.

Для определения активности отдельных изоферментов их предварительно выделяют различными методами: хроматографические, изоэлектрического фокусирования, электрофоретические, селективного ингибирования

Существующие методы изучения активности альфа-амилазы в биожидкостях (сыв-ке, моче, поте) делятся ан 2 основные группы: 1. Сахарирующие, основанные на исследовании образующихся из крахмала сахаров по редуцирующему действию глюкозы и мальтозы. 2. Амилокластические, базирующиеся на определении остатка нерасщепленного крахмала по степени интенсивности его реакции с йодом. Йодометрические основаны на способности избытка негидролизованного субстрата давать с йодом окрашенные соед-ия, интенсивность окраски зависит от состава субстрата. Активность фермента определяют по убыли оптической плотности раствора субстрата после его гидролиза альфа-амилазой. Другая группа методов определения активности альфа-амилазы основана на использовании хромогенных нерастворимых субстратов. Хромогенный субстрат представляет собой полисахарид, ктр вследствие ковалентного связывания с красителем становится нерастворимым. Методы различаются как используемым субстратом (крахмал, амилопектин, амилоза), так и связанным с ним красителем. Альфа-амилаза гидролизует субстрат с образованием растворимого хромогена. После остановки реакции непрореагировавший нерастворимый субстрат удаляют центрифугированием, и в супернатанте определяют оптическую плотность хромогена; для лучшей воспроизводимости рекомендуют фильтрование супернатанта. Активность фермента рассчитывают, пользуясь стандартом (препаратом альфа-амилазы) или контрольной сывороткой с известной активностью фермента (при этом учитывают спонтанный гидролиз хромогенного субстрата). Единицы активности устанавливают по коэффициенту абсорбции хромогена.

КДЗ. Активность а-а. крови и мочи в теч сут значительно меняется. Учитывая колебания экскреции а-а. с мочой, рекомендуется исследовать исследовать акт-ть фермента в моче, собранной за сутки. Питание: при увел-ии утилизации глюкозы содержание а-а. в крови снижается. Эмоциональные, стрессовые состояния, напротив, приводят к гиперамилаземии. Изменяется при беременности (до 19 нед – умен-ся, затем увел-ся достигая максимума к 33-34 нед Бер-ти, на 37-40 незнач снижается.

Гиперамилаземия. При заб-ях подж/ж: о. панкреатит – увел-ся в 10-40 раз. Максимума достигает ч/з 12-24 ч, затем быстро снижается и приходит к норме на 2-6 сут. Обычно гипарамилазурия длится дольше, чем гиперамилаземия. Возможно развитие о. панкреатита и без повышения активности фермента в частности при тотальном панкреонекрозе. Известно, что акт-ть а-а. подавляется при действии большого кол-ва молекул нейтральных жиров на активный центр фермента. В связи с этим следует особенно внимательно подходить к интерпретации результатов исследования активности а-а. у больных панкреатитом с сопутствующим нарушением липидного обмена. Гипреферментемия носит, как правило, кратковременный хар-р. Поэтому при наличии др симптомов о. панкреатита и нормальной активности фермента при поступлении пациентов в стационар необходимо повторять исследования акт-ти а-а. ежесуточно в ближайшие 3-5 сут. Активность сыв-ой а-а. не всегда отражает тяжесть. Активность не изменяется или умен-ся при гипертриацилглицеринемии (хилезная плазма). Имеются данные, что развивается о. панкреатит на фоне достаточно выраженных гиперлипемий и гипертриацилглицеринемий. Это обусловлено тем, что панкреатическая липаза способна превращать триацилглицерины в свободные ЖК, повреждающие железу.

В диагностике заб-ия о. панкреатитавожную дополнительную информацию к активности дает определение амилазокреатининового клиренса: (α-а(мочи)*Кр_с)/(Кр_м*α-а(сыв-ки) *100, где КР – сод-ие креатинина. В норме от 1 до 4%. Если более 6% - указывает на наличие панкреатита. Это объясняется тем, что при панкреатите увел-ся уровень истинной панкреатической а-а., очищение от ктр на 80% выше таковой а-а. слюны. У здоровых а-а. фильтруется в почечных клубочках, а затеем реабсорбируется в канальцах. пр панкр вследствие избыточной фильтрации клубочками Р- и S-а. механизм канальциевой реабсорбции подавляется. По этой причине не уровень а-а. сыв-ки и амилазокреатининовый клиренс обычно повышены. Поскольку амилолитическая акт-тьсыв-ки при о.панкр обусловлена в основном Р-изомером а-а., то при увеличении тотального клиренса повышается выделение с мочой этого изифермента а-а. при заб-ия же, лишь протекающих под маской панкреатита, амилазокреатининовый клиренс остается нормальным (т.к. отсут-т канальцевый эффект), хотя активность а-а. в сыв-ке крови часто увеличивается..

Для повышения диагностической специфичности теста определения амилолитической активности сыв-ки крови рекомендуется предварительно ингибировать S-изоамилазу специальным препаратом.

Активность а-а. при послеоперационном панкреатите повышается к концу 1-х суток, ч/з 3 сут снижается, приходя на 5-е сут к дооперационном уровню. Аналогичные изменения наблюдаются и при операционных вмешательств на др органах брюшной полости. У больных с хр панкреатитом, раком подж/ж не отмечается резкого возрастания активности а-а. крови, для диагностики этих заб-ий используют провокационные тесты.

Пов-ие акт-ти м.б. при о. аппендиците, перитоните (развиваются образующие амилазу бактерии), перфоративной язве желудка и 12 п.к., холецистит, состояние связанной с разрывом желчного пузыря, заб-ия почек, почечную недост-ть, метастазирование раковой опухоли в легкие, поражение сл/ж с абтурацией их протоков, простатит,ЧМТ, травмат шок, ожоги, пневмонии, диабетический кетоацидоз, прерывание беременности, послеоперационный период.

При макроамилаземии акт-ть фермента повыш-ся в сыв-ке крови и снижается в моче. В этом случае молекулы фермента из-за их большой величины не выделяются почками.

Основные причины гиперамилаземии – нарушение оттока секретов желез, повышение проницаемости гистогематического барьера в железах, некрозы тканей, нарушение выведения фермента ч/з почечный фильтр.

Повы-а-а.: адреналин, гистамин, секретин, фуросемид, салицилаты, антикоагулянты, морфин, пантопон, опий, кодеин, тетрациклин, алкоголь, кортизан и кортикостерон. Загрязнение лабораторной посуды – ложнозавышенный рез-т.

Несмотря на то, что гиперамилаземия почти постоянно сопровождается гиперамилазурией, определение активности а-а. мочи не всегда м. служить точным показателем диагностики, т.к. выход а-а. в мочу связан с почками, к тому же почки выделяют из крови только 24% инкретированной пищеварительными железами амилазы.

Исследование акт-ти а-а. в суточной моче – более надежный биохимический тест выявления заболевания подж/ж, чем исследование разовой ее порции. После того как активность а-а. крови после приступа панкреатита возвратится к норме, она м. оставаться повышенной в моче до 7 сут.

Повышение активности а-а. в сыв-ке крови у больных с хр заб-ями почек и о. уремией м. объяснить уменьшением или прекращением выделения фермента ч/з почки.

Гипоамилаземия в клинической практике встречается редко. С заб-ями печени (гепатит, цирроз), злок опухолями, обширные ожоги кожи, сах диабет, гипотиреоз, общее расстройство питания, падение массы тела, кахексия, интоксикация (токсикоз), что чаще связано с недостаточностью эндокринной функции подж/ж. к уменьшению активности фермента приводит введение в организм цитратов и оксалатов.

Липаза. Термин липаза, введенный в 1896 году Генриоттом, в наст. Время исп-ся для обозначения ферментов, сп-х расщеплять нейтральные жиры (сложные эфиры глицерола и высших карбоновых кислот).

Липаза панкреатическая (ПЛ) – фермент поджелудочной железы, участвующий в расщеплении липидов, поступающий в ЖКТ вместе с пищей.

Для исследования фермента нужна предварительная активация с использованием тонкодисперсной эмульсии жира, поскольку на границе «масло-вода» происходит развертывание глобулы ф с высвобождением активных центров молекул. ПЛ водорастворима и ее действие ограничивается поверхностью жировых глобул. Желчные кислоты ум-ют поверхностное натяжение, что приводит к образованию эмульсий в тонком кишечнике => увелич контакта м/д жирами и липазой; активизируют ф. ПЛ ингибируется свободными жирными к.

Среди лаб способов исследования внешнесекреторных функций ПЖ различают:

1. Титриметрические методы, учитывающие образовоние жирных к в процессе распада их глицериновых эфиров (состоят в титровании щелочью жирных к)

2. Сталагмометрические, базирующиеся на регистрации изменения поверхностного натяжения – сталагмометрия

3. Турбидиметрические, основанные на оценке степени мцтности раствора

4. Газометрические, состоящии в определении объема СО2, выделяемого под действием освободившихся жирных к на гидрокарбонаты.

Перечисленные методики не нашли широкого распространения из-за небольшой спец-сти, низкой точности.

5. Колориметрические, с использ хромогенных субстратов.

КДЗ: ↑ акт-сти при панкреатите, особенно остром. У больных панкреатитом одновременно исследуют акт-сть в крови и моче (т.к. в моче выше). ↑ - при желчной колике, странгуляции или инфаркте кишки, перфорации полого органа, ожирения, подагре, у части больных с СД, уремии, о недостаточности почек.

↓ - при туберкулезе, сифилисе, раке, при инфекционных заб, по мере прогрессирования процесса активность снижается.

Норма - > 190 Е/л, при о панкреатите, задержке желчи в печени, хр панкреатите (обструктивном), недостаточности деят-сти почек значительно увеличивается.