Приложение I

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА СТРЕПТОКОККОВОЙ АНГИНЫ

 

Бактериологическое и иммуномикробиологическое обследование больных ангиной проводят в целях этиологического подтверждения клинического диагноза, контроля за полнотой освобождения реконвалесцентов от возбудителя и оценки возможного риска развития у переболевших ангиной ревматизма и острого гломерулонефрита.

Стрептококки группы А относятся к факультативным анаэробам с оптимальной температурой роста 37^о С и рН= 7,6-7,8. В питательные среды для их культивирования добавляется дефибринированная баранья или лошадиная кровь (в агаризованные среды - 5-7%) или лошадиная, крупного рогатого скота сыворотка (в жидкие среды - 10-20%).

В мазках из растущих бульонных культур стрептококки выявляются в виде длинных цепочек, в мазках с плотных питательных сред - в виде коротких цепочек, парных или разбросанных неправильных скоплений кокков. При росте на кровяном агаре стрептококки группы А так же, как и стрептококки некоторых других групп (B, C, G), вызывают бета-гемолиз. В результате бета-гемолиза вокруг колоний образуются прозрачные бесцветные зоны. Эритроциты в этих зонах полностью лизируются. Другой вид гемолиза (альфа-гемолиз) стрептококки группы А не вызывают. При альфа-гемолизе вокруг колоний образуется нечеткая зона частичного разрушения эритроцитов, часто с появлением зеленовато-коричневой окраски среды. Иногда наблюдается вариант альфа-гемолиза, когда непосредственно вокруг колоний образуется небольшой ореол из целых или частично лизированных эритроцитов, а к нему примыкает зона полного гемолиза, распространяющаяся далее в среду. При визуальном просмотре такой вариант альфа-гемолиза можно спутать с бета-гемолизом. В сомнительных случаях чашку с питательной средой (без добавления крови) инокулируют штрихом. Засеянную среду заливают 10 мл кровяного агара. После инкубирования при 37^оС в течение 18-24 ч альфа- и бета-гемолиз при данной методике выражен более четко, поскольку колонии погружены в агар и это обеспечивает некоторую защиту гемолизинов, способных инактивироваться под действием кислорода. Для более выраженного роста колоний и получения более четкого гемолиза засеянные чашки можно инкубировать в атмосфере, содержащей до 10% углекислого газа. Для этого чашки с посевами помещают в эксикатор с плотно притертой крышкой или в анаэростат, на дно которых ставят зажженную свечу. По мере возрастания концентрации углекислого газа свеча гаснет, создавая благоприятные условия для роста стрептококков.

Групповая идентификация бета-гемолитических стрептококков основана на обнаружении группоспецифического полисахарида С с помощью различных иммунологических реакций (преципитации, латекс-агглютинации и др.). В качестве антигена выступают не цельные микробные клетки, а их экстракты, полученные после обработки центрифугата чистой культуры стрептококка кислотами (соляной или азотной) или различными ферментами.

Типирование стрептококков группы А по М-белку, липопротеиназе, с использованием групповых и типовых анти-Т диагностических сывороток в настоящее время малодоступно.

Для обеспечения микробиологической диагностики стрептококковой инфекции имеются в продаже все необходимые питательные среды и диагностикумы.

Кровяной агар и питательный бульон готовят на основе триптического перевара Хоттингера с содержанием аминного азота 7-8 г/л.

Кровяной агар.

К 100 мл перевара Хоттингера добавляют 20,0 агар-агара, 5,0 хлористого натрия, 5,0 пептона и 900 мл дистиллированной воды, варят в течение 10-15 мин, доводят рН до 7,8, фильтруют через вату, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при 120^о С (1 атм) 20 мин. Приготовленный питательный агар остужают до 45-50^о С и добавляют 5-7% (по объему) дефибринированной лошадиной или лучше бараньей крови. Человеческую кровь использовать для этих целей нельзя, так как она может содержать антибиотики или антитела к стрептококку, что вызовет угнетение роста возбудителя. Для угнетения роста посторонней микрофлоры целесообразно добавление генцианового фиолетового, кристаллического фиолетового в конечной концентрации 1:10⁶

Среды обогащения.

Для диагностики можно использовать коммерческую селективную добавку для стрептококков (предприятие "БиолоТ", г. Санкт-Петербург), которую вносят в питательные среды с целью подавления роста сопутствующей микрофлоры. В качестве сред обогащения используют сахарный бульон для стрептококков (к 100 мл МПБ добавляют 1% глюкозы, стерилизуют в автоклаве при 111,8^о С (0,5 атм) 30 мин. В бульон непосредственно перед употреблением добавляют лошадиную (крупного рогатого скота) сыворотку до 10-20%) и среду для контроля стерильности (СКС), которые разливают в пробирки по 3-5 мл.

Схема бактериологической диагностики.

Материалом для бактериологического исследования на наличие стрептококка служит отделяемое слизистой оболочки задней стенки глотки и зева. Материал берут сухим ватным тампоном, фиксируя язык шпателем, чтобы не было увлажнения тампона слюной. Нельзя брать материал в течение двух часов после еды или полоскания рта.

Взятый материал используют немедленно для посева на кровяной агар или отправляют в лабораторию. Тампоны помещают в пробирку с транспортной питательной средой, которой может служить среда СКС.

I этап исследования.

Из доставленного материала готовят мазки и окрашивают их по Граму.

Взятый для исследования материал засевают на чашки Петри с кровяным агаром. Для получения изолированных колоний на один из участков агаровой пластинки наносят тампоном исследуемый материал, а затем легкими штрихами распределяют его по всей поверхности питательной среды с помощью бактериологической петли или тонкого шпателя. Чашки с посевом выдерживают в термостате при 37^о С 18-24 ч, а затем производят учет посевов.

Для надежного выявления гемолиза производят посев тампоном на кровяной агар и заливают сверху 10-15 мл кровяного агара. Через 18-24 ч инкубации при 37^о С в толще агара и на его поверхности наблюдается рост колоний с бета-гемолизом, которые легко снимаются бактериологической петлей.

Из исследуемого материала также производят посев в среду обогащения.

II этап исследования.

На кровяном агаре стрептококки образуют мелкие (1-2 мм в диаметре) прозрачные, полупрозрачные или непрозрачные колонии серовато-белого цвета.

По виду гемолиза на кровяном агаре стрептококки группы А относят к бета-гемолитическим стрептококкам, способным вызывать полный лизис эритроцитов (полное просветление среды) вокруг образованных ими колоний. В свою очередь эти колонии могут быть слизистыми (прозрачные, 1,5-2,5 мм в диаметре, правильной круглой формы, напоминающие капельки росы), матовыми (шероховатые, 1,5-2,5 мм в диаметре, серовато-белого цвета с характерным слегка приподнятым центром) и блестящими (мелкие, 1-1,5 мм в диаметре, круглые, с ровным краем, блестящей и влажной поверхностью). Слизистые формы колоний характерны для свежевыделенных штаммов S.pyogenes, матовые формы - для образующих большое количество М-белка вирулентных стрептококков, а блестящие - для слабо- и авирулентных штаммов S.pyogenes и многих штаммов S.agalactiae.

Из числа колоний с бета-гемолизом отбирают характерные колонии и 2-3 из них отвивают на сектора чашек или скошенный кровяной агар для накопления чистой культуры.

Посевы инкубируют в термостате при 37^оС 18-24 ч.

На жидких питательных средах S.pyogenes образуют придонно-пристеночный рост с образованием мелкозернистого осадка и

сохранением полной прозрачности среды. Некоторые штаммы вызывают интенсивное помутнение бульона с образованием небольшого гомогенного осадка. В приготовленных из бульонных культур мазках стрептококки располагаются обычно в виде длинных цепочек (7-8 и более кокков).

Из подозрительных в отношении стрептококков колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для первых генераций стрептококков часто характерен выраженный полиморфизм: наряду с типичными шаровидными клетками встречаются вытянутые в длину кокки различной величины.

III этап исследования.

После визуальной проверки чистоты выделенных культур определяют их принадлежность к стрептококкам группы А. С этой целью проводят изучение биохимических и серологических свойств.

Для видовой идентификации стрептококков наибольшее дифференциально-диагностическое значение имеют следующие тесты: определение вида гемолиза на кровяном агаре, проба на каталазу, чувствительность к бацитрацину и сульфаниламидам (сульфаметоксазолу и триметоприму), САМР-тест, гидролиз гиппурата натрия, желчно-эскулиновый тест, рост в бульоне с 6,5% NaCl, наличие PYR (пирролидонилариламидазы) и характер группового полисахаридного антигена.

Проба на каталазу. Тест основан на способности обладающих этим ферментом микроорганизмов расщеплять перекись водорода с образованием кислорода и воды. Для постановки этого теста чистую культуру изучаемого штамма помещают с помощью стеклянной палочки в каплю 3-10% раствора перекиси водорода на предметном стекле и растирают круговыми движениями. В положительных случаях наблюдают выделение пузырьков газа. В отличие от стафилококков, стрептококки не обладают ферментом каталаза.

Проба с бацитрацином и сульфаниламидами. Для предварительной идентификации S.pyogenes и бета-гемолитических стрептококков групп C и G используют два диска из фильтровальной бумаги, один из которых импрегнирован раствором антибиотика бацитрацина (0,04 ЕД/диск), а второй - смесью сульфаметоксазона (23,75 мкг/диск) и триметоприма (1,25 мкг/диск). Диски помещают на чашку с кровяным агаром, засеянную испытуемой культурой и инкубируют 18-24 ч в аэробных условиях. Любая видимая зона задержки роста вокруг дисков интерпретируется как чувствительность к этим антимикробным препаратам (положительный результат). Абсолютное большинство штаммов

S.pyoge-nes чувствительны к бацитрацину, а стрептококков групп C и G - к смеси сульфаметоксазона и триметоприма.

Таблица 1

Основные биологические свойства стрептококков

 

Микроорганизмы   Свойства	S.pyogenes	S.agalactiae	Стрептококки группы C и G	S.bovis
Вид гемолиза на кровяном агаре	b	b, a	b	a, g
Гидролиз гиппурата натрия	-	+	-	-
CAMP-тест	-	+	-	-
Наличие PYR	+	-	-	-
Желчно-эскулиновый тест	-	-	-	+
Рост в бульоне с 6,5% NaCl	-	+	-	-
Чувствительность к бацитрацину	+	-	-	-
Чувствительность к сульфаметоксазолу и триметоприму	-	-	+	+

 

 

САМР-тест. Большая часть стрептококков группы В (S.agalactiae) продуцирует экстрацеллюлярный протеин (САМР-фактор), который при взаимодействии с бета-лизином золотистого стафилококка вызывает синергическое усиление лизиса эритроцитов. Для постановки САМР-теста через центр чашки с кровяным агаром сплошной линией наносят суточную бульонную культуру продуцирующего бета-лизин S.aureus (АТСС 33862). Испытуемые штаммы стрептококков наносят перпендикулярно к линии посева стафилококка не доходя 2-3 мм. В качестве контрольных используют штаммы S.agalactiae (положительный контроль) и S.pyogenes (отрицательный контроль). При обнаружении в месте пересечения посевов стрептококка и стафилококка спустя 18 ч инкубации при температуре 37^о С зоны синергического увеличения гемолиза в виде "крыла бабочки" делают вывод о наличии в пробе S.agalactiae.

Гидролиз гиппурата натрия. В основе данного теста лежит способность стрептококков группы В вызывать гидролиз гиппурат натрия. Для его постановки петля чистой культуры исследуемого штамма суспендируется в 0,4 мл 1% водного раствора гиппурата натрия. Спустя 2 ч инкубации при температуре 37^о С добавляют 0,2 мл 3,5% раствора нингидрина в смеси бутанола и ацетона (1:1). При положительном результате после повторной инкубации в течение 10 мин появляется пурпурное окрашивание.

Желчно-эскулиновый тест. Используется для предварительной идентификации стрептококков группы D (S.bovis), которые растут на желчно-эскулиновом агаре с образованием комплекса темно-коричневого или черного цвета. Исследуемую культуру стрептококка засевают на питательный агар, содержащий 40% желчи, 0,1% эскулина и 0,05% цитрата железа. Учет результатов производят через 24-48 ч инкубации при температуре 37^о С.

Рост в бульоне с 6,5% раствором NaCl. Простой и доступный тест для предварительной дифференциации стрептококков группы В, которые в отличие от других стрептококков устойчивы к высокой концентрации хлористого натрия. Учет результатов производят через 24-48 ч инкубации при температуре 37^о С.

PYR-тест. В основе метода лежит обнаружение фермента пирролидонилариламидазы (PYR), который имеется у большинства штаммов

S.pyogenes и не встречается у других стрептококков. Небольшое количество (0,2 мл) питательного бульона, содержащего 0,01% L-пирролидонил-бета-нафтиламида, инокулируют полной петлей исследуемой культуры и инкубируют при температуре 37^о С в течение 4 ч. После добавления одной капли коммерческого реактива (диметиламиноациннамальдегид) в положительных случаях появляется ярко-красное окрашивание.

Иммунологическая дифференциация стрептококков. Основана на обнаружении полисахаридного антигена клеточной стенки (группоспецифического полисахарида С). Выпускаемые в настоящее время диагностикумы обеспечивают серологическую идентификацию стрептококков групп А, В, С, F, G.

Антиген получают путем экстракции группового полисахарида стрептококка азотной кислотой. Исследуемую культуру выращивают в 3 мл бульона для стрептококков (37^о С, 18-24 ч), центрифугируют (2000-3000 об/мин, 30 мин), надосадочную жидкость максимально удаляют. К осадку добавляют 40 мкл 3М раствора азотистокислого натрия и 9 мкл ледяной уксусной кислоты, смесь взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин. Затем в присутствии 5 мкл индикатора фенолового красного (0,4% водный раствор) заранее подобранным объемом 5-10 нормального раствора едкого натрия рН доводят до 7,2-7,5 (различные оттенки оранжевого цвета). При отсутствии микропипеток экстракцию проводят в капельном варианте: 7 капель 3М раствора азотистокислого натрия, 3 капли ледяной уксусной кислоты, 1 капля индикатора. Техника постановки реакции та же.

Реакцию иммунопреципитации в агаре ставят на стекле размером 9х12 см (отмытая от эмульсии фотопластинка). Стекло заливают 15-17 мл 1% осветленного голодного агара на 0,85% растворе хлористого натрия. Стекло должно находиться на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаре по трафарету делают центральные лунки для диагностической сыворотки (диаметр 6 мм) и вокруг них, на расстоянии 9 мм - периферические лунки для антигенов (диаметр 3 мм). Реакция протекает при комнатной температуре в условиях влажной камеры, поэтому штатив со стеклами помещают в герметически закрывающийся полиэтиленовый пакет, содержащий комок влажной ваты или крышку чашки Петри с водой. Учет результатов реакции осуществляют через 12-18 ч. Специфичность образующихся линий преципитации проверяют по их совпадению с линиями контрольных антигенов.

Липопротеиназной активностью обладают только стрептококки группы А. Следовательно, бета-гемолитические стрептококки, вызывающие помутнения сыворотки, могут быть сразу отнесены к группе А.

Реакцию помутнения сыворотки ставят следующим образом: к осадку исследуемой культуры, полученному вышеописанным способом, добавляют 0,5-1,0 мл (в зависимости от диаметра пробирки) коммерческой сыворотки крупного рогатого скота с мертиолятом (конечная концентрация 1:2000); смесь энергично встряхивают и затем инкубируют 24-48 ч при температуре 37^о С. После центрифугирования при 2000-3000 об/мин в течении 20 мин производят визуальную оценку результата относительно интактной сыворотки. Каждую серию сыворотки предварительно проверяют с контрольным липопротеиназным штаммом.

Серологическая диагностика стрептококковых инфекций в лабораторных отделениях чаще всего ограничивается определением титра антител к экстрацеллюлярным продуктам стрептококка - стрептолизину-О и ферменту гиалуронидазе. Для проведения исследований используют парные сыворотки больных, взятые с интервалом в 7-10 дней. Титры антистрептолизина-О у практически здоровых людей не превышают 250 международных единиц (АЕstO). При острых и хронических стрептококковых инфекциях они возрастают, причем при наличии ревматизма или нефрита с первых дней заболевания отмечаются очень высокие титры антител (500 AEstO и выше). Определение титра антигиалуронидазы (АЕНуS) широко используется в диагностике активности ревматического процесса. У практически здоровых людей они, как правило, не превышают 300 единиц (AEHyS), а у больных ревматизмом достигают 1000 единиц и более.

Методы экспресс-диагностики стрептококковых инфекций

Бета-гемолитические стрептококки группы А способны вызывать у человека тяжелые постстрептококковые осложнения (ревматизм и гломерулонефрит), для профилактики которых большое значение имеет своевременное начало этиотропной антимикробной терапии. Для обнаружения пиогенного стрептококка непосредственно в полученном от больного клиническом материале используются реакция коагглютинации и метод флюоресцирующих антител (МФА).

Реакция коагглютинации основана на применении группоспецифических антител против бета-гемолитического стрептококка группы А, сорбированных на клетках золотистого стафилококка. Тампон с исследуемым материалом помещают в пробирку, в которую добавляют раствор для экстрагирования полисахаридного антигена клеточной стенки стрептококков. Каплю полученного экстракта наносят на предметное стекло и смешивают с каплей специфического иммунодиагностикума. Появление через 2-3 мин хлопьев агглютината и просветление раствора свидетельствует о положительном результате.

МФА, основанный на использовании меченых флюорохромом специфических антител против стрептококков группы А, можно применять как для непосредственного обнаружения S.pyogenes в нативном материале (экспресс-диагностика), так и на этапах выделения возбудителя после получения изолированных колоний или чистой культуры (ускоренная диагностика)