МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯДля обследования больных разработана специальная карта, в которую вносились общие сведения, данные акушерско-гинекологического и соматического анализа, результаты лабораторных исследований в динамике и эффективность проводимых лечебно-диагностических мероприятий. Всем больным проводились бактериологические и бактериоскопические исследования содержимого влагалища, цервикального канала, уретры, цитологические исследования мазков - отпечатков на атипические клетки. Идентификацию хламидий, уреаплазмы, гарднерелл, микоплазмы, цитомегаловируса, проводили в лаборатории микробиологии БГМУ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выявления БВ и контроля эффективности лечения определяли рН-метрию вагинального содержимого с помощью универсальных индикаторных полосок с диапазоном измерения рН 0- 12 (Lachemd). Во избежание ошибок в клиническом диагнозе обследования не проводили во время менструации. Предварительный диагноз БВ был установлен при наличии 3-х из 4-х перечисленных признаков: - наличие гомогенных выделений из влагалища белого или серого цвета, с резким запахом; - рН>4,5; - положительный аминный тест; - наличие "ключевых" клеток. При проведении аминотеста в каплю вагинального содержимого, нанесенного на предметное стекло вносится ровное количество 10% раствора КОН. При положительном аминотесте определяется запах "тухлой рыбы", обусловленных выработкой диаминов (путрецин, кадаверин) в процессе реакции декарбоксилирования аминокислот облигатными анаэробами. Соли этих соединений превращаются в летучие амины при щелочном значении рН. Наличие "ключевых клеток" выявляли при микроскопическом исследовании влагалищных мазков. Мазки окрашивали по Граму. Суть метода заключается в том, что "ключевые клетки" (Glue cells) представляют собой эпителиальные клетки (поверхностный слой влагалищного эпителия), на которых по всей поверхности плотно и в большом количестве располагаются грамвариабельные палочки. Грам (+) микроорганизмы окрашиваются основным красителем в темно-фиолетовый цвет, Грам (-), воспринимая дополнительную окраску, приобретают ярко-малиновый цвет. К недостаткам этого метода следует отнести определенные трудности при отнесении выявленных микроорганизмов к Грам (+) или Грам (-) по свету из-за их неоднородного прокрашивания ввиду возможности присутствия в вагинальном мазке большого количества слизи и разнообразных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. В этой связи в своей работе мы использовали метод предложенный Мавзютовым А.Р, и соавт. – окраска метиленовым синим. При использовании данной окраски происходит оптимальное прокрашивание препарата метиленовым синим Грам (+) флоры в голубые тона и Грам (-) - в интенсивный иссиня-черный цвет. 1. Микробиологическое исследование отделяемого женских половых органов проводилось по унифицированным методам. Материал для исследования брался стерильным ватным тампоном из заднего свода влагалища, до проведения мануального исследования. Взятый материал доставляли в лабораторию не позже, чем через 1-2 часа. В баклаборатории материал засевали штрихами на кровяной агар. Производили также посевы в сахарный бульон. Посевы инкубировали при 37° в термостате в течение суток. При появлении роста на плотных питательных средах, проводили их идентификацию и подсчитывали число колоний, количественно оценивая соотношение видов в данной микробной ассоциации. При помутнении сахарного бульона, делали высевы на плотные питательные среды (кровяной агар, среда Эндо). Идентификацию выделенных микроорганизмов по видовой принадлежности и определение чувствительности к антибиотикам проводили по общепринятым методикам с учетом рекомендаций в приказе МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико- диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». При наличии положительных посевов определяли чувствительность выделенных штаммов к антибиотикам методом стандартных дисков. 2. Материал для бактериоскопии равномерно распределяли на стекле мягкими движениями, избегая грубого втирания и резких штриховых движений инструментом. Такая техника выполнения мазков позволяет клеткам распределяться слоями, не повреждая их, сохраняя истинное распределение и количественные соотношения компонентов исследуемого материала. После высушивания при комнатной температуре мазки окрашивали по Граму. Бактериоскопия проводилась световым микроскопом с использованием иммерсионной системы. 3. ПЦР-полимеразная цепная реакция, является объективной методикой, позволяющей идентифицировать в жидкостях и тканях организма хламидии, уреаплазмы, гарднереллы, микоплазмы, цитомегаловирус, вирусы герпеса 1 и II и другие. Принцип: материал для ПЦР собирают в пробирки с буферным раствором. Хранят в морозильных камерах при температуре - 20°С не более одного месяца, повторное замораживание и оттаивание не допускается. Материал в объеме 100 мкл смешивают со 100 мкл лизирующего буфера (1% ТВИН-20,0; 1% NP-40,60 мкг/мл протеиназы К). Смесь инкубируют при 56°С в течение 2-х часов, после чего инактивируют при 95°С в течение 10 минут. Термическая обработка необходима для инактивации протеиназы К и обеззараживания клинического материала. Инактивированные образцы центрифугируют при 1000 g 10 минут. Супернатант собирают и используют для проведения ПЦР. Проведение ПЦР: реагенты вносят в реакционную пробирку в следующей последовательности: а) вода бидистиллированная до 30 мкл конечного объема смеси; б) реакционный буфер 10х - 2,5 мкл; в) 650 мм р-р MgCl2 - 1,2 мкл; г) смесь 2 NTP's - 2,5 мкл; д) Tag полимераза- 1- 1,5 ед.; е) олигонуклеотидные праймеры - 15 ммоль; ж) контрольный образец или клинический образец - 1-2 мкл.
Для предохранения от испарения поверхность реакционной смеси наслаивают 30 мкл минерального масла. Пробирки помещают в амплификатор. Проводят ПЦР в следующих температурных режимах: 96°С 4 минуты, 55°С 10 минут - 1 цикл; 95°С 1 минута, 55°С 1 минута, 72°С 2 минуты - 35 циклов. После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Наличие специфического фермента ДНК определяют с помощью контрольной ДНК исследуемого возбудителя, амплифицированной одновременно с клиническими образцами. Результат анализа считается положительным в следующих случаях: 1) Размер ДНК-продукта в клиническом образце точно соответствует ДНК-продукту положительной контрольной пробы. 2) В пробе, содержащей клинический образец и внутренний стандарт, идентифицируют специфический ДНК-продукт внутреннего стандарта. 3) В пробе, содержащей вместо клинического образца аликвоту воды (отр. контроль), ДНК-продукт не обнаруживают. Результат анализа считается отрицательным в следующих случаях: 1) В пробе, содержащей клинический образец, специфический ДНК- продукт не обнаруживается. 2) Результаты ПЦР в обеих контрольных пробах - как в предыдущем случае. Анализ повторяется в следующих случаях: 1) В пробе, содержащей контрольную ДНК, специфический продукт не обнаружен. 2) В пробе с внутренним стандартом специфический продукт не обнаружен. 3) В отрицательном контроле обнаружен специфический ДНК продукт. На основании проведенных микробиологических исследований нами предложена микроскопическая классификация БВ по трем степеням. 1-ая степень - компенсированный, для которого характерно полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизменных эпителиоцитах. Указанное состояние слизистой влагалища не является патологическим, но отсутствие лактобактериальной флоры свидетельствует о принципиальной возможности заселения пустующей экологической ниши попадающими с наружных половых органов микроорганизмов, и последующим формированием БВ в виду естественной колонизационной резистентности слизистой. 2-ая степень субкомпенсированный характеризуется количественным снижением лактобактерий, возрастанием количества сопутствующей грамвариабельной полиморфной бактериальной флоры и появлениями в поле зрения единичных (1- 5) "ключевых" клеток при относительно умеренном лейкоцитозе (15- 25 в поле зрения). 3 степень декомпенсированный, с выраженными симптомокомплексом БВ и микроскопически характеризуется полным отсутствием лактобактерий, когда все поле зрения заполнено "ключевыми" клетками. Бактериальная флора представлена самыми различными микроорганизмами как в монокультуре, так и в различных морфо- и видовых состояниях. Количество гликогена в эпителиальных клетках влагалищных мазков определяли методом Мак-Мануса и реакцией Шифф-йодной кислоты (ШИК-реакция). Определение концентрации цитокинов было проведено методом иммуноферментного анализа (ИФА) в сыворотке крови и влагалищном содержимом в динамике. Содержание провоспалительных (IL-1b, IL-2, TNF-a, IL-6) и противовоспалительного (IL-4) цитокинов определяли твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента по стандартной методике с использованием тест-систем ProCon (ООО «Протеиновый контур», г. С.-Петербург) в сыворотке крови пациентов и влагалищном содержимом. Забор 0,3-0,4 мл цервикальном жидкости инсулиновым шприцем осуществлялся в процессе лечения. Взятие 5 мл крови проводили натощак из локтевой вены обследуемых в стерильных условиях без использования раствора антикоагулянта для получения сыворотки. Определение уровней цитокинов в сыворотке крови осуществляли также через 1 сутки, 1 неделю и 1 месяц после начала лечения. Учет результатов проводили с использованием автоматического фотометра «Униплан» (Россия) при длине волны 450 нм. Нормальный уровень цитокинов IL-1b, IL-4, TNF-a и IL-6 в сыворотке крови здоровых людей, как правило, не превышает 50 пкг/мл, содержание IL-2 составляет 20-1000 пкг/мл. Статистическая обработка цифрового материала проводилась по группам женщин методами, принятыми санитарной статистикой с использованием ПЭВМ Pentium IV. В каждой клинической группе для оценки определенных показателей составляли вариационные ряды с последующей их обработкой: расчетом показателей структуры (в %), определением средней арифметической (М), квадратического отклонения (а), средней квадратической ошибки (т). Оценка достоверности результатов проводилась с применением критерия Стьюдента (t).
|
