Практика разведения дрожжей для стартера и анализ полученных результатовВыше были представлены несколько способов размножения дрожжей. Выбор того или иного варианта подразумевает те или иные особенности подготовки пивного сусла и соответствующую степень его стерильности. Методика представленная в книге First Steps in Yeast Culture volume 1 by P. Rajotte прописана автором очень тщательно и применялась им в течении многих лет. По этой причине не приходится сомневаться ни в методах «стерилизации» сусла, ни в других технических приемах. Однако я бы не рекомендовал заливать кипяченое в кастрюле сусло в колбу для разведения на магнитной мешалке, в соответствии с методикой представленной на рисунке 5, даже если горло колбы будет потом прикрыто кусочком фольги. Тому есть несколько причин. Методика описанная П.Райотом, подразумевает небольшие кратности разбавления. Так порция дрожжей предназначенная для брожения партии пива в несколько галлонов, заливается вначале 100 мл сусла. В таком объеме, за вычетом непродолжительной фазы задержки, дрожжи быстро создадут условия неприемлемые для развития посторонней микробиоты. Далее следует добавление еще 300 мл и т.д. Такая методика предоставляет возможность самой культуре дрожжей создать надежную оборону от многочисленных непрошеных гостей. Пивовару следует лишь побеспокоиться о контаминантах — убить с помощью тщательного кипячения разного рода бациллы и дикие дрожжи, надежно упаковать сусло и сохранить его в холодильнике. Как было отмечено выше, в условиях крупного производства сусло для разведения повторно кипятится в дрожжевых отделениях (согласно Кунце). При этом кратность разбавления все же существенно меньше чем на рисунке 5, где 10 мл культуры предлагается залить в 1000 мл сусла (более чем в 100-кратное разбавление). При таких начальных условиях (менее миллиона клеток на миллилитр сусла — столь мало не рекомендуется засевать даже в пиво) концентрация дрожжевых клеток долгое время будет оставаться на очень низком уровне, что чревато угрозой развития посторонней микробиоты. Объективно, магнитная мешалка, как устройство для удаления углекислого газа из бродящей среды, способна обеспечить рост популяции дрожжей от сверхнизких начальных значений плотности клеток до очень больших (250 и более млн/мл). Однако сусло для этой процедуры нужно готовить очень тщательно и лучшим вариантом представляется стерилизация. Ранее уже отмечалось, что чаще всего для целей разведения используются остатки сусла от предыдущей варки. В тех случаях, когда сусло совсем не подходит для производства следующего пива, можно использовать DME. Это происходит, когда вслед за стаутом, вариться, например, пшеничное. В этой ситуации даже небольшое количество темного сусла способно испортить цвет нового пива. После фильтрации через стерильные салфетки (проглаженные горячим утюгом с паром) сусло попадает вот в такие колбы, оснащенные сифонами.
Рисунок 9. Колбы с суслом для стартера.
Рисунок 10. Колбы на водяной бане. Сейчас в колбах уже обработанное сусло, поэтому установлены санирующие фильтры. Когда сусло внутри колбы остывает после обработки на водяной бане и водяной пар конденсируется внутри колбы освободившееся место должен занять стерильный воздух. Это обеспечивает фильтр. Фильтры можно устанавливать до обработки и не снимать их вовсе. Необходимо, также, обратить внимание на две другие трубки (рисунок 9). Как можно заметить они соединены с помощью двух фрагментов шланга и одной металлической трубкой. Это позволяет снизить давление на пробку колбы и она при обработке останется на месте. В дальнейшем, при переливе сусла, короткий шланг закрывается зажимом, а длинный используется для подключения к реторте со стартером).
Рисунок 11. Баня закрыта для получения внутри температуры более 90 градусов. На фотографиях видно, что фильтры надеты на трубки сифона с помощью силиконового шланга. Этот шланг стерилизуется вместе с фильтром в автоклаве. После каждого использования фильтр опускается шлангом вниз в колбочку со спиртом (70%) до полного заполнения шланга. В такой позиции конструкция выдерживается не менее 15-20 минут (обычно сутки — этого достаточно для стерилизации хорошего уровня) затем фильтр медленно вынимается, чтобы шланг заполнялся стерильным воздухом, прошедшем через мембрану фильтра, и свободный конец шланга закрывается стерильной алюминиевой фольгой. Таким образом удается иметь полностью стерильный фильтр готовый к любому применению. Перед установкой фильтра металлическая трубка сифона обжигается ручной газовой горелкой. В последнее время я использую другой прием обеспечения стерильности. Каждый фильтр снабжается металлической трубкой, а шланг предельно укорачивается. Теперь обжигается и трубка фильтра, что обеспечивает стерильность без длительного замачивания в спирте. Присоединение фильтра осуществляется к стерильному шлангу. Испоьзование вот такой горелки очень удобно.
Для разведения из культуральных пробирок, содержащих всего 5 мл бродящего пива (после засева небольшой колонии с уклона), я применяю стерильное сусло, обработанное при температуре свыше 121 градуса Цельсия. Дрожжи из фирменных пробирок
попадают в стерильную реторту, изображение которой уже неоднократно появлялось в этих материалах. Реторту я обычно стерилизую в духовке сухим жаром при температуре 180 градусов Цельсия, там же стерилизуется завернутый в фольгу сифон. Колба плотно заткнута обычной ватой, горло также закрыто алюминиевой фольгой для защиты от пыли и микробов.
Рисунок 12. Стерилизация реторты в духовке.
Рисунок 13. Реторта в сборе на магнитной мешалке с подключенной колбой 1 литр. В реторте хорошо флокуирующие дрожжи — видно как они образуют хлопья. На концах шлангов установлены зажимы. Сифон реторты состоит из трех трубок нержавеющей стали. Самая короткая, — для отвода СО2 или подачи стерильного воздуха (через фильтр) во время перелива в ферментер. Второй, самый длинный, достает до дна реторты. По этой трубке пиво и дрожжи попадают в емкость для брожения. Третий, промежуточной длины используется для заполнения реторты суслом из колбы, показанной на рисунке 9, а также для аэрации пространства реторты (над суслом) стерильным воздухом. Все шланги имеют стальные наконечники для обжига газовой горелкой перед соединением. Сборку реторты я делаю в своем перчаточном шкафу (ныне «ламинарном»), который предварительно обрабатывается изнутри спиртом и ультрафиолетовой бактерицидной лампой. Это можно сделать и без шкафа, обработав рабочее место аналогичным образом и работая аккуратно (например с использованием маски, шапочки и перчаток обработанных спиртом. Однако у меня есть шкаф и я использую это достаточно чистое место. Перед установкой сифона, дрожжи из фирменной пробирки заливаются внутрь реторты. Хочу подчеркнуть, что для смешивания культуры и сусла необходимо чтобы и то и другое имело комнатную температуру. Никогда не смешивайте холодные дрожжи и сусло из холодильника — вы погубите культуру.
Рисунок 14. Для отбора проб из реторты служит стерильная колба (100 мл) со стерильным сифоном. Было проведено ряд брожений с участием двух культур при различных температурах и условиях перемешивания. Необходимо подчеркнуть, что применялось охмеленное сусло. Для отбора проб использовалась колба (рисунок 14), которая всякий раз тщательно продувалась стерильным углекислым газом. Результату приведены в таблице.
Лагерные дрожжи WLP833 разводились на мешалке (стартер) при температуре 19 градусов. Начальный объем сусла в реторте составлял 500 мл, после чего добавлялось еще 800 мл. Затем стартер перекачвался в бродильную емкость (38 литров) и разведение продолжалось при 17 градусах при непрерывном перемешивании сусла. После чего делался засев в бродильную емкость содержащую 530 литров сусла и брожение продолжалось при 12 градусах. Элевые дрожжи WLP036 (германский эль) разводились на мешалке (стартер) при 22 градусах, начальный объем сусла составлял 800 мл, через 12 часов добавлялось еще 800 мл, после разведения стартер перекачивался в емкость для брожения, где процесс ферментации продолжался при 19,5 градусах безо всякого перемешивания. Результаты подсчета клеток представлены в виде трех графиков отражающих соответственно: концентрацию клеток в сусле (рисунок 15), приплод клеток — разницу между начальной концентрацией и текущим результатом (рисунок 16), и двоичный логарифм отношения полного числа клеток к изначально заданному в сусло (рисунок 17). Первый рисунок показывает сколько клеток может вырасти в одном миллилитре сусла при различных условиях перемешивания. Второй — характеризует количество вновь появившихся клеток за минусом их первоначального количества. Это позволяет определить сколько новых клеток появляется при тех или иных условиях, что, собственно, и представляет интерес при разведении. Третий рисунок, при всей кажущейся сложности представленной зависимости, имеет очень простой смысл и показывает количество удвоений дрожжевых клеток на текущий момент времени, то есть характеризует скорость роста клеток.
Рисунок 15. Концентрация клеток в одном миллилитре сусла. Рисунок 16. Приплод клеток в одном миллилитре сусла.
Рисунок 17. «Скорость» размножения клеток — число удвоений.
На рисунке 18 показано изменение экстрактивности сусла во время брожения. Из рисунка 15 видно, что точки на синей, зеленой и коричневой линиях представляют собой практически одну кривую. Это не особенно очевидно для зеленых точек. Однако вторая из них была снята явно поздно и данная концентрация клеток, вероятно, была достигнута существенно раньше. Это можно определить по виду дрожжевых клеток.
Рисунок 20. Активно растущие клетки. Заметно большое количество молодых почек. Об этом же свидетельствует остаточный экстракт — 4 градуса плато, явно мало для нормального роста. На рисунке 15 последняя точка синей кривой соответствуют концентрации клеток 250 млн/мл. Я связываю такую высокую конечную концентрацию с исключительно высокой начальной — 96 млн/мл. На рисунке 16 прирост числа клеток (синяя кривая) уже не настолько сильно отличается от других случаев. Интересно поведение голубой кривой рисунка 15— она загибается вверх в районе 100 млн/мл. Этот график показывает концентрацию дрожжей при обычном элевом брожении. Пробы взяты снизу бродильной емкости. Отмеченный поворот вверх характеризует осаждение дрожжей и остановку размножения. Понятно, что в случае применения перемешивания дрожжи не оседают и рост их так или иначе продолжается до больших концентраций. Таким образом использование магнитной мешалки оказывается целесообразным при разведении. Оранжевая кривая рисунков 15 и 18 демонстрирует, что лагерные дрожжи также вряд ли стоило размножать при перемешивании и 17 градусах более суток — экстракт упал ниже 6 градусов, молодых почек нет совсем (рисунок 21). Это еще не картина стационарной фазы, где можно наблюдать одинаковые крупные дрожжи (рисунок 22), но переход к ней. Как видно из рисунка 6, размножение культуры в ассимиляторе при сходной температуре не превышает 24 часов. При этом количество дрожжей увеличивается примерно в пять раз, что тоже очень хорошо согласуется с рисунком 17 (оранжевая кривая).
Рисунок 22. Лагерные дрожжи в стационарной фазе. Несколько слов необходимо сказать о желтой кривой. Она характеризует брожение пива с низкой начальной нормой засева. Результат налицо — не удалось получить более 30 млн/мл дрожжевых клеток. Брожение вялое, несмотря на высокую экстрактивность. Результат появиться не скоро. Как видно из рисунка 16 во всех случаях, кроме одного, удалось получить более 100 млн/мл новых клеток. Так как магнитная мешалка (коричневая, синяя и зеленая кривые) и перемешивание в бродильной емкости (оранжевая кривая) не дают дрожжам спокойно осесть на дно, концентрация в этих случаях оказывается выше, чем при обычном брожении (голубая кривая). Однако, как показывает наличие остаточного экстракта и морфология клеток, вряд ли стоит гнаться за большим приплодом с использованием принудительного перемешивания. Во всяком случае при таком способе размножения необходимо соблюдать осторожность. На подобные мысли наводят явные признаки автолиза, появившиеся заметно раньше у пробы дрожжей соответствующей последней точке оранжевой кривой. Кривые рисунка 17 показывают число удвоений количества клеток — то есть среднее число делений одной дрожжевой клетки на две. Если на предыдущих графиках коричневые, синие и зеленые точки ложились практически на одну линию характеризующую процесс размножения на магнитной мешалке, то в этом случае мы видим четкое разделение точек и кривых с одной стороны по типу штамма, а с другой стороны по температуре разведения. Из рисунка видно, что дрожжи для эля растут (делятся) быстрее, чем дрожжи для лагера. При этом с понижением температуры скорость размножения (деления) клеток падает. Как видно из графиков (оранжевая кривая) дрожжи не только медленнее растут, но и медленнее потребляют питательные вещества сусла. Интересно отметить, что наличие или отсутствие перемешивания практически не влияет на скорость роста (деления) клеток. Таким образом магнитная мешалка не является «ускорителем» роста дрожжей, она лишь поддерживает клетки во взвешенном состоянии и таким способом продлевает время их активного питания и размножения. Также осуществляется интенсивный газообмен — СО2 удаляется и, если пространство над бродящим суслом содержит кислород, осуществляется аэрация. Дрожжи после разведения на мешалке в течение 20 часов в объеме 1600 мл (один долив 800 мл сусла) при конечной концентрации клеток 150 млн/мл были засеяны в 27 литров сусла. Признаки брожения в виде пузырьков из газоотводной трубки, наблюдались примерно через час. Главное брожение протекало около 2-х суток. В момент написания этих строк дрожжи оседают и, вероятно, к вечеру будут слиты из конуса бродильной емкости. Дрожжи 833 все еще сбраживают свое пиво. Причин тому несколько. Однако главная из них низкая норма засева. Приведенные выше результаты могут быть полезны (кроме желтой кривой) для определения времени брожения стартера и расчета его объема для обеспечения нормы засева. Желтая крива лишь показывает роль нормы засева сусла для жизни и размножения дрожжевых клеток во время брожения. Зеленая, синяя и коричневая кривые на графиках 15 и 16 демонстрируют, что не смотря на различные начальные концентрации клеток, от 30 до 90 млн/мл, можно получить урожай в объеме около 100 млн/мл здоровых дрожжей, примерно, за 10 часов, (судя по коричневой кривой даже за меньшее время). Питательные сахара сусла при этом снижаются до уровня 4 градусов плато. Если опять судить по коричневым точкам, (которых просто больше), то на урожай в 80 млн/мл «требуется» понижение экстрактивности около 3-х градусов плато. Лишнее время размножения, как в случае зеленой кривой, приводят к нерациональному потреблению экстракта сусла (на поддержание жизнедеятельности без размножения) — более 7 градусов на 100 млн/мл урожая. Обычно не известно сколько живых клеток в пузырьке с дрожжами. В этой ситуации может пригодиться регулярный контроль экстрактивности бродящего стартера с помощью рефрактометра. Как только эта величина понизилась в указанных выше пределах — можно делать вывод об урожайности (приросте клеток). По времени роста имеется возможность прикинуть по графику (рисунок 17) число удвоений и получить (правда, приблизительно) начальную концентрацию живых клеток в пробирке. Сложить эти две концентрации, умножить на объем бродящего стартера и получить количество клеток. Указанные расчеты дадут примерные величины. Вероятно, даже очень приблизительные. Однако по затратам времени и сил это все же проще регулярного забора проб и подсчета клеток под микроскопом, который требует владения техникой этого дела, и самое главное времени. При этом результаты таких подсчетов также могут содержать весьма заметные расхождения по самым разным причинам, анализ которых также может потребовать еще больших временных затрат. Несколько слов о лагерных дрожжах. Имея дело в основном с элевым брожением и соответствующими культурами, я был очень удивлен медленным ростом лагерных штаммов, особенно при пониженных температурах. Я конечно читал, что 12 градусов это не оптимальная температура для биохимии дрожжевой клетки, но не представлял себе масштаб замедления жизненных процессов. После проделанных измерений, картина стала более или менее ясной. Оказалось что на каждое удвоение при 17 градусах дрожжам требуется вдвое больше времени, чем при 19-20 градусах. Чтобы получить приплод клеток в 50 млн/мл требуется уже не 7 часов, а около 20. Таким образом стало ясно, что нельзя говорить о разведении дрожжей вообще. Нужно точно оговаривать температуру при которой происходит этот процесс и некоторые другие вещи (например, породу штамма). Может быть в домашних условиях не стоит растить лагерные дрожжи при 16-17 градусах. Вероятно, целесообразно вырастить их побыстрее при 20 и затем плавно охладить в финале разведения, чтобы дрожжи сохранили активность. Осталось только придумать алгоритм плавного охлаждения в пределах отдельной квартиры — нужно иметь как минимум пару холодильников с температурой 16 и 12 градусов. Хотя это может оказаться недостаточно плавно. P. Rajotte рекомендует понижать температуру при размножении лагерных штаммов с шагом 2 градуса в сутки 21 — 19 — 17 — 15 — 13 — 11, от первого брожения в пробирке маленького кусочка колонии дрожжей с уклона до литрового стартера. При этом возникнет и другая проблема — при теплом разведение в объеме стартера будут присутствовать неуместные для лагера концентрации высших спиртов и, возможно, других соединений, и, соответственно, испортить вкус будущего пива. Что делать с этим? Вероятно, можно охладить стартер до температуры 5-6 градусов или ниже, чтобы дрожжи осели и слить «неправильное» пиво. Однако в этом случае потребуются специальные меры, чтобы вернуть культуру к активной жизни к моменту засева в сусло. Если ограничиться лишь плавным нагревом до температуры брожения (или на 4-5 градусов ниже), это вряд ли позволит избежать продолжительной фазы задержки после внесения. В финале хочется сказать несколько слов о связи чрезмерной продолжительности размножения и последующих результатах брожения. В процессе приготовления пива дома, иногда возникают вынужденные отклонения от четкого следования плану варки. Такие досадные нарушения графика по большей части и являются источником опыта «как не нужно делать». Несколько подобных случаев с дрожжами WLP002 показали, что длительное — более суток, размножение дрожжей на магнитной мешалке (без соответствующего дополнительного разбавления бродящего стартера свежим суслом), неблагоприятно влияют на результат последующего брожения. Продолжительность активной фазы (главного) брожения увеличивается с 2-х до 4-х — 5-ти суток. Ослабление падает с 76% до до 67% (одни лишние сутки) и 62% (двое — трое лишних суток). Оседание дрожжей также может происходить в разы дольше. Перелив пива в КЕГ (после разведения дрожжей в течение 1-х суток) делался на 4-ые сутки от начала брожения. В случае превышения суточного интервала разведения — на восьмые-девятые.
|
