В ТКАНЯХ ОРГАНОВ

 

ПРИНЦИП РАБОТЫ:

В основе спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного А.С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм.

 

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) НСlО₄, 0,2 н. и 0,5 н. растворы; 2) пробирки обычные, мерные и центрифужные; 3) водяная баня; 4) центрифуга с холодильником; 5) СФ-46.

ХОД РАБОТЫ:

1. 100-200 мг измельченной на холоду ткани помещают в центрифужную пробирку с 5-10 мл охлажденного 0,2 н. раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при охлаждении.

2. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок повторно отмывают хлорной кислотой (такая обработка необходима для удаления кислото-растворимых нуклеотидов): к осадку добавляют 5-10 мл0,5 н. раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушными холодильниками, нагревают их на кипящей водяной бане 30 мин. Эта процедура необходима для количественной экстракции нуклеиновых кислот из исследуемой ткани и кислотного гидролиза.

3. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

4. Надосадочную жидкость сливают в отдельную чистую пробирку.

5. Осадок подвергают повторной экстракции 0,5 н. раствором хлорной кислоты: к осадку добавляют 5-10 мл0,5 н. раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушными холодильниками, нагревают их на кипящей водяной бане 30 мин.

6. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

7. Надосадочную жидкость сливают в отдельную чистую пробирку и объединяют с полученной в п.4. Точно измеряют общий объем.

8. Определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против 0,5 н. раствора хлорной кислоты. При необходимости исследуемый раствор разводят 0,5 н. раствором хлорной кислоты.

9. Рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл исследуемого раствора по формуле:

С_{фосфора} = А₂₇₀ - А₂₉₀ /0,19 (мкг),

где 0,19 - значение Δ А (А₂₇₀ – А₂₉₀), которое имеет гидролизат нуклеиновых кислот, содержащий 1 мкг нуклеинового фосфора в 1 мл раствора.

При дальнейших расчетах учитывают общий объем гидролизата и разведения.

10. Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются пересчетным коэффициентом 10,3:

С_нк = С_{фосфора} ∙ 10,3 (мкг).

11. Рассчитывают содержание нуклеиновых кислот в 1 г исследуемой ткани.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОДЫ:

 

 

Работа №5