Совокупность гранул, которыми заполнена колонка, называется сорбентом. Пористые гранулы работают как молекулярные «сита» или «ловушки», задерживая маленькие молекулы внутри пор. Крупные молекулы не могут проникнуть внутрь пор и протекают между гранулами («исключаются»). Этот набор содержит восемь колонок, уже заполненных сорбентом, который способен эффективно разделять, или «фракционировать», молекулы весом до 60 000 Да. Когда жидкость, содержащая разные молекулы, течет через колонку, молекулы весом до 60 000 Да проникают внутрь пор и задерживаются там. Чем меньше молекулы, тем медленнее они проходят через слой сорбента. Молекулы с молекулярным весом больше чем 60 000 Да не способны попасть внутрь гранул и очень быстро протекают между ними. Таким образом, 60 000 Да это так называемый предел проникновения или эксклюзионный предел колонки.
Жидкость, в которой растворены биомолекулы, образующая подвижную фазу, называется буфером. Растворенная в жидкости смесь разделяемых биомолекул называется образцом. Образец наносится на поверхность сорбента, и биомолекулы фильтруются через гранулы сорбента или вокруг них, в итоге вытекая через маленькое отверстие на дне колонки. Чтобы процесс разделения прошел до конца, после нанесения образца сверху дополнительно наливается буфер. Вытекающая из колонки жидкость последовательно собирается в пробирки, по определенному числу капель в каждую. Таким образом, каждая пробирка содержит определенную фракцию. Собранные в начале фракции содержат крупные молекулы, которые не задерживаются на колонке. Маленькие молекулы, способные проникать внутрь гранул сорбента, выходят в более
поздних фракциях. В этой лабораторной работе разделяются две молекулы – гемоглобин и витамин В12. Коричневый гемоглобин имеет молекулярный вес 65 000 Да и не способен проникнуть в поры используемого сорбента. Гемоглобин быстро протечет через колонку и появится в первых собранных фракциях. Витамин В12 имеет молекулярный вес 1350 Да и разделяется на колонке. Молекулы витамина В12 проникают внутрь гранул сорбента и временно задерживаются там. В результате, они будут проходить через колонку гораздо медленнее и появятся в более поздних фракциях. Приведенная ниже схема иллюстрирует разделение крупных и маленьких молекул в процессе эксклюзионной хроматографии.
