Оптична мікроскопія

Перейдемо до розгляду оптичної системи мікроскопу і його основних характеристик. Мікроскоп являє собою ЦОС, яка у найпростішому випадку складається з двох лінз: об’єктива і окуляра. Хід променів у мікроскопі зображений на мал. 8.18.

Мал. 8.18.Схематичний хід променів у мікроскопі.

У мікроскопі предмет АВ розміщується безпосередньо за переднім фокусом об’єктива (Об). В такому випадку його зображення А₁В₁ буде дійсним, оберненим, збільшеним і знаходитиметься за подвійним фокусом об’єктива. Бажано, щоб окуляр (Ок) розміщувався так, щоб площина, в якій лежить зображення А₁В₁, знаходилася у фокальній площині окуляра або між його переднім фокусом і самим окуляром, але в безпосередній близькості від фокуса F₂. В першому випадку око не напружується, оскільки до нього йдуть паралельні промені. В другому випадку потрібна акомода­ція (див. параграф 8.7, де викладаються біофізичні основи зорової рецепції), щоб зібрати промені, що розходяться після заломлення в окулярі, на сітківку ока.

Розглянемо перший випадок. Як видно з мал. 8.18, зображення А₁В₁ предмета АВ знаходиться у фокальній площині окуляра, і тому всі промені після заломлення в окулярі йдуть від цього зображення паралельно до побічної вісі, яка з’єднує точку А₁ і оптичний центр лінзи окуляра О₁. Заломлююча система ока, яка має в середньому оптичну силу 63 дптр, фокусує ці паралельні промені на сітківку, де виникає зображення А₂В₂ реального предмета АВ.

Збільшення мікроскопу Г_м, як і збільшення будь-якої ЦОС, визначається добутком збільшення лінз, які входять до її складу:

, (8.11)

де L – оптична довжина тубуса – відстань між заднім головним фокусом об’єктива і переднім головним фокусом окуляра, D – відстань найкращого зору (D » 25 см).

Таким чином, теоретичне збільшення мікроскопа дорівнює відношенню добутку оптичної довжини тубуса на відстань найкращого зору до добутку фокусних відстаней об’єктива і окуляра.

Основні характеристики мікроскопа – роздільна здат­ність, межа розрізнення і корисне збільшення.

Роздільна здатність – властивість мікроскопа дава­ти окремо зображення двох, поряд розміщених, світлих точок предмету.

Теорія роздільної здатності мікроскопа була розроблена Е. Аббе, а потім Л.І. Мандельштамом і Д.С. Рождественсь­ким. Роздільна здатність мікроскопу обумовлена хвильови­ми властивостями світла і перед усім дифракційними явища­ми. Вона визначається роздільною здатністю об’єкти­ва, в який входять промені світла, що дифрагують на структурних деталях предмету, і залежить, таким чином, від апертурного кута q і довжини хвилі. Роздільна здатність є характеристикою, яка обернена до межі розрізненняZ_min – найменшої відстані між двома світлими точками предмету, які сприймаються в мікроскопі окремо. Чим менша межа розрізнення, тим вища роздільна здатність оптичного приладу.

В теорії Аббе формула для межі розрізнення Z_min має вигляд для “сухого” мікроскопа:

.

При використанні імерсійного об’єктива (тобто у ви­пад­ку, коли між предметом і об’єктивом розміщена рідина з показником заломлення n) значно збільшується яскравість зображення і роздільна здатність мікроскопу. У цьому випадку формула для межі розрізнення набуває вигляду:

. (8.12)

Величина називається числовою аперту­рою. Оцінимо цю величину. Максимальна кутова апертура q_max ~ 70°, тоді для сухого об’єктива А = sin 70° = 0.94, а для імерсійного якщо n = 1.5, А = 1.5 × 0.94 = 1.4. Використо­вуючи світло з мкм, до якого найбільш чутливе людське око, отримаємо для межі розрізнення такі значен­ня: для сухого мікроскопу Z_min = 0.3 мкм, а для імерсійного мікроскопа Z_min = 0.2 мкм.

Не має сенсу нескінченно зменшувати Z_min, оскільки деталі предмету повинні розрізнятися і оком. Реальне збіль­шен­ня мікроскопа визначається так званим корисним збіль­шеннямГ_корис, яке визначається співвідношенням:

,

де Z¢ – межа розрізнення ока, тобто розмір зображення на сітківці ока предмета, який має величину, що співпадає з межою розрізнення мікроскопа Z_min на віддалі найкращого зору D = 25 см.

Нормальне око розрізняє дві точки, кутові віддалі між якими мають порядок 2¢–4¢, тобто декілька кутових хвилин. Тоді для такої кутової віддалі межа розрізнення ока дорівнює

.

Таким чином, корисне збільшення мікроскопа

Г_корис = (140 ¸ 280) 2 А / l₀ .

Тоді для сухого мікроскопа при l₀ = 0.555 мкм і число­вій апертурі А = 0.94 маємо:

Г_корис = 500 ¸ 1000,

а для імерсійного мікроскопа з числовою апертурою

Г_корис = 700 ¸ 1400.

Отже, у звичайному оптичному мікроскопі корисне збільшення не може перевищувати значення Г_корис » 1500. Ці збільшення називають корисними, тому що при них око розрізняє всі елементи структури об’єкта, які розрізнені мікроскопом.

Для вирішення різноманітних задач у біологічних дослідженнях використовують різні методи спостереження об’єктів за допомогою мікроскопа, основними з яких є наступні:

- методи світлого і темного полів у відбитих променях або променях, що проходять крізь об’єкт;

- методи спостереження в поляризованому і люмінесцент­ному світлі;

- метод фазового контрасту;

- метод ультрамікроскопії та інші.