Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Молекулярно-генетические методы. Использование в медицине




 

Молекулярно-генетические методы (методы ДНК –диагностики) – это большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК. ДНК- методы используются в следующих направлениях:

1. Для диагностики моногенных и мультифакториальных наследственных болезней.

2. Для пренатальной диагностики моногенных болезней или пола плода (в случаях Х – сцепленного наследования).

3. В судебной медицине для идентификации личности (геномная дактилоскопия) и установления родства.

4. Для диагностики инфекционных заболеваний.

5. Для диагностики онкологических заболеваний.

Возможности диагностики связаны с осуществлением программы «Геном человека». Перечень моногенных болезней, диагностируемых молекулярными методами, и доступных пренатальной диагностике: муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна-Беккера, гемофилия (А и В), фенилкетонурия, болезнь Хантера (мукополисахаридоз), адрено – генитальный синдром , хорея Гентингтона, синдром фрагильной Х-хромосомы и др.

В 1993 году таких заболеваний было 130, в 1994 году – 600, сейчас еще больше. Сейчас возможна диагностика любого наследственного заболевания, ген которого картирован и доступен прямой или косвенной диагностике.

В перспективе будет возможно говорить о «генетическом паспорте новорожденных», то есть о том, что уже вскоре после рождений с помощью автоматизированной системы удастся проанализировать весь спектор наиболее распространенных заболеваний как моногенных, так и мультифакториальных.

 

Молекулярно-генетические методы можно разделить на прямые и косвенные.

Прямая диагностика проводится в тех случаях, когда строение гена уже изучено. Она включает секвенирование ДНК, регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК, трансляцию белкового продукта in vitro и др. Косвенное выявление мутацийприменяется в тех случаях, когда строение гена не известно и вместе с тем имеется информация о других структурах, находящихся рядом с геном – определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и др.

Рассмотрим некоторые из них.

Секвенирование ДНК - это наиболее точный метод, так как позволяет определить строение гена и выявить любую мутацию. Методики секвенирования весьма трудоемки, требуют значительных затрат материалов и времени, в связи с чем не нашли широкого применения в клинической генетике, а применяются главным образом для расшифровки генома человека.

С открытием в начале 70-х годов рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) - ферментов, способных разрезать нити ДНК в строго определенных участках - сайтах рестрикции, исследователи получили возможность выделять более мелкие и в то же время стабильные по длине и легче идентифицируемые фрагменты. Определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (RFLP – restriction fragments length polymorphism) один из распространенных методов ДНК-диагностики. Принцип метода: выделенная ДНК обрабатывается ферментами, которые «разрезают» ее на фрагменты в строго определенных участках (сайтах рестрикции). Патологические мутации могут изменять сайты рестрикции, что приводит к изменению длин полученных фрагментов.

Несколько позже широкое развитие получили различные способы изучения последовательностей ДНК с помощью олигонуклеотидных зондов - искусственно синтезированных коротких цепей нуклеотидов, меченных радиоактивными метками. При определенных условиях указанные зонды могут специфически связываться (гибридизоваться) с комплементарными последовательностями в анализируемой ДНК, свидетельствуя тем самым о присутствии искомого фрагмента.

Выделение ДНК для исследования указанными методами представляет собой достаточно трудоемкую процедуру. Во-первых, ДНК в клетках содержится в относительно небольших количествах по сравнению с другими веществами, поэтому для получения очищенных препаратов требуются сложные и дорогие методы. Во-вторых, молекулы ДНК, особенно эукариот, имеют значительную длину и представляют собой весьма хрупкую цепь, которая при различных биохимических манипуляциях оказывается так или иначе поврежденной.

Для выделения ДНК полученный биологический материал обрабатывают протеолитическими ферментами, чтобы удалить все белки. ДНК адсорбируют на пористых носителях или экстрагируют органическими растворителями, после чего следует многократное очищение. При этом получают всю ДНК клеток (геномную ДНК).

Исследователя обычно интересует только определенный, специфический участок ДНК, который трудно идентифицируется среди множества других, в том числе нетранскрибируемых ДНК-последовательностей. Эта задача решалась с помощью трудоемкого подхода - путем клонирования фрагментов ДНК (т.е.размножения) в различных организмах (т.н. векторах), чаще всего в фагах (вирусах бактерий) или во внехромосомных наследственных единицах - плазмидах. При этом интересующий фрагмент молекулы ДНК какого-либо организма вначале встраивался в геном фага либо в кольцевую ДНК плазмиды при помощи специальных ферментов - рестриктаз, нуклеаз, полимераз и лигаз, после чего происходило заражение бактерий фагом (трансдукция) или внесение плазмидной ДНК в цитоплазму микроорганизма (трансформация). Размножение бактерий тем самым вело к накоплению достаточно больших количеств интересующих исследователя фрагментов ДНК.

Однако процедуры молекулярного клонирования весьма трудоемки, требуют работы с радиоактивными веществами, высокой степени очистки ДНК, поэтому они практически не вышли за рамки крупных специализированных лабораторий, хотя необходимость исследования ДНК на уровне нуклеотидных последовательностей давно стала потребностью практического здравоохранения.

Указанные трудности были преодолены с открытием в 1983 г. К.Б.Мюллисом (США) метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), который нашел широкое применение в самых различных областях практической медицины.

 







Дата добавления: 2014-11-12; просмотров: 536. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.005 сек.) русская версия | украинская версия