Ферменты в генной инженерии:
Ферменты, применяемые в генетической инженерии, можно разделить на четыре основные группы: •ферменты, фрагментирующие НК; •ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК; •ферменты, лигирующие фрагменты ДНК; •ферменты, модифицирующие концы НК. Нуклеазы. Могут разрезать НК с образованием 3’- гидроксильной или 5’- гидроксильной группы ДНКазы 1) Эндонуклеазы- М.б. специфичными к одноцепочечным или двухцепочечным ДНК 2) Экзонуклеазы -5’® 3’-экзонуклеазы -3’® 5’-экзонуклеазы РНКазы Н - Расщепляют РНК в составе гибрида ДНК-РНК. Бывают эндонуклеазы или 3’® 5’-экзонуклеазы. Активностью РНКазы Н обладает обратная транскриптаза Рестриктазы. входит в состав системы рестрикции-метилирования бактерий. Система рестрикции-метилирования служит для защиты бактерий от вирусов. Рестриктазы и метилазы специфичны к первичной структуре ДНК. Метилазы метилируют ДНК. Рестриктазы разрезают ДНК Фосфатаза - гидролизует 3’- или 5’- фосфомоноэфиры. Полинуклеотидкиназа - фосфорилирует 5’-концевые гидроксильные группы ДНК и РНК, но не фосфорилирует 3’-гидроксильные группы; используется для мечения 5’- конца полинуклеотидной цепи с помощью радиоактивного Р-32 в составе АТФ ДНК-лигаза - катализирует образование фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. ДНК-лигаза фага Т4 или E.coli катализируют реакции ДНК-полимераза I - требует для работы матрицу и затравку, обладает полимеразной и 5’® 3’- и 3’® 5’-экзонуклеаз-ными активностями ДНК-полимераза I - способна заполнять брешь, ревращать липкие концы в тупые Обратная транскриптаза - требует затравку Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза - не нуждается в матрице, но требует затравку. Поли-А-полимераза - присоединяет поли-А к РНК, в качестве субстрата использует АТФ
49. Генная инженерия бактерий. -выделение или синтез гена,-введение чужеродного гена в вектор,-введение химерного вектора в бактериальную клетку,-размножение бактерий, -выделение и очистка синтезированного чужеродного белка ВЫДЕЛЕНИЕ И СИНТЕЗ ГЕНА -Выделение матричной РНК и синтез кДНК -Выделение гена из библиотеки генома -Синтез гена по известной первичной последовательности ДНК или белка -Синтез гена с помощью ПЦР -Введение чужеродного гена в вектор Плазмиды могут нести гены устойчивости к антибиотикам. Используют плазмиды с двумя генами устойчивости к антибитикам. Сайт встраивания чужеродной ДНК в плазмиду находится в одном из генов устойчивости к антибиотикам. Второй ген обуславливает способность бактерии, имеющий эту плазмиду, существовать в среде в присутствии антибиотика. ВВЕДЕНИЕ ХИМЕРНОГО ВЕКТОРА В БАКТЕРИАЛЬНУЮ КЛЕТКУ - Рекомбинантными плазмидами обрабатывают бактериальные клетки. Обработку проводят в среде в присутствии ионов кальция, через раствор пропуская короткие импульсы тока При выращивании клеток в среде в присутствии антибиотика бесплазмидные клетки погибнут. Бактерии с рекомбинантной и нерекомбинантной плазмидами будут расти на среде в присутствии указанного антибиотика. Бактерии с рекомбинантной плазмидой будут чувствительны к другому антибиотику. На основании чувствительности к антибиотикам отбирают клоны бактерий с рекомбинантной плазмидой. Бактерии с рекомбинантной плазмидой размножают. В генетической инженерии широко используют плазмиды, несущие ген устойчивости к антибиотику и ген бета-галактозидазы. Бета-галактозидаза опредяляет голубой цвет колоний. Встраивание чужеродной ДНК осуществляют в ген бета-галактозидазы. Бактерии содержащие рекомбинантную плазмиду будут расти в присутствии антибиотика и будут при этом бесцветными. Бактерии содержащие нерекомбинантную плазмиду будут расти в присутствии антибиотика и будут при этом голубыми. Бесплазмидные бактериальные клетки в присутствии антибиотика погибнут. Для экспрессии чужеродных генов необходимо, чтобы перед геном располагались бактериальный промотор и регуляторные участки. Плазмиды бывают: -однокопийными (одна копия на клетку) -мультикопийные (обычно 10-20 копий на клетку -плазмиды с ослабленным контролем репликации (могут накапливаться в клетке до 1000 копий) В качестве векторов используют: 1. Фазмиды – искусственные гибриды между фагом и плазмидой. Фаг + плазмида = фазмида Фазмиды в одних условиях могут размножаться как плазмиды, а в других как фаги 2. Челночные плазмиды содержат последовательности ДНК, позволяющие существовать как в бактериальных клетках, так и в дрожжах Векторы на основе фага l: фаг l - 48502 п.н.
|
