Амплификация РНК

Геномы многих вирусов представлены РНК. В их жизненных циклах отсутствует промежуточная фаза превращения в ДНК. При выявлении РНК ее необходимо перевести в форму ДНК. Для этого используют термостабильную обратную транскриптазу

Для проведения обратной транскрипции в среде должны присутствовать праймеры и дНТФ. После обратной транскрипции, полученные кДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР

 

 

44. ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени позволяет осуществлять детекцию продуктов амплификации во время проведения эксперимента. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входят флуоресцентная метка в 5’-положении и гаситель в 3”-положении. ДНК-зонды комплементарны участку амплификации. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение. Фосфатная группа в 3’-положении блокирует полимеразу. В ходе ПЦР на стадии отжига ДНК-зонды присоединяются к участку амплификации. Во время элонгации полимераза при достижении зонда благодаря 5’-экзонуклеазной активности выщепляет флуоресцентную метку. Происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя

Усиливается свечение. Чем больше ампликонв образовалось, тем интенсивнеесвечение.

Перспективы использования ПЦР

-диагностика инфекционных заболеваний

-диагностика генетических заболеваний

-диагностика онкологических заболеваний

-диагностика патогенов в пище

-диагностика генетически модифицированных продуктов

-идентификация личности

При диагностики инфекционных заболеваний используются праймеры, специфичные к участкам ДНК возбудителей, но не пациентов. ПЦР позволяет выявить возбудителя заболевания в очень низкой концентрации. При диагностики генетических болезней используются праймеры, специфичные к генам, обуславливающих данное заболевание. При диагностики генетически модифицированных продуктов используют праймеры, комплементарные к трансгенам.