Генная инженерия растений.

Первое в мире трансгенное растение - САНБИН (SUNBEEN) - получено в результате переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника

Для конструирования трансгенного растения нужно:

-Выделить или синтезировать ген

-Разработать методы включения гена в геном растения

-Регенерировать из единичных клеток растение с измененным генотипом

Агробактерии как объектгенетической инженерии растений: В группе почвенных бактерий Agrobackteria есть несколько видов, способных вызывать образование опухолей (корончатых галлов) у растений. Опухолеродным агентом у этих бактерии является Ti – плазмида, которая частично интегрирует в геном растений.

Ti-плазмида содержит:

T-ДНК (12-20 тыс. п.о.), T-ДНК встраивается в геном растений и кодирует ферменты биосинтеза фитогормонов и опинов (производных аминокислот)

-vir-область, содержит гены, ответственные за перенос Т-ДНК

-tra-область, включает гены, контролирующие конъюгацию бактерий

-ori-область, содержит гены, ответственные за репликацию Ti-плазмиды

Ti-плазмиды можно использовать в качестве вектора:

-круг хозяев агробактерий широк

-интегрированная в геном Т-ДНК наследуется как доминантный признак

Этапы трансформации:

-вырезание Т-ДНК из Ti-плазмиды с использованием рестриктаз

-клонирование Т-ДНК в плазмиде рВR322 E.coli

-встраивание в клонированную Т-ДНК чужеродного гена

-заражение гибридной плазмидой агробактерий

-рекомбинация гибридной плазмиды с Ti-плазмидой

-получение трансформированных клеток

-получение из трансформированных клеток трансгенных растений

Векторная система на основе Ti-плазмид должна:

-содержать сигналы для переноса и интеграции Т-ДНК в ядерный геном растений

-содержать систему обеспечивающую экспрессию чужеродных генов (промотор)

-содержать маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток

-не содержать онкогенов, подавляющих дифференцировку растительных клеток

Требование к промотору: промотор должен узнаваться РНК-полимеразой растений; должен обладать достаточной силой; может использоваться регулируемый промотор (промотор генов белков теплового шока); наиболее популярным промотором является промотор гена вируса мозаики цветной капусты. В векторной системы должны присутствовать маркеры.

Другие методы трансформации растительных клеток

ДНК-пушка - Вирус легко проникает в клетку и в ней размножается. Число копий вирусного генома в клетке может достигать 50 000. Столько же копий чужеродного гена. Это может обеспечить сверхсинтез белкового продукта.Размер чужеродного гена ограничен (около 800 п.н.). Вирусы имеют ограниченный круг хозяев.

Прямая трансформация - ДНК, несущую трансген, инкубируют с растительными клетками в присутствии химических веществ, облегчающих перенос ДНК в протопласт (полиэтиленгликоль). Частота трансформаций очень низка, около 10^-4 – 10^-5.

Микроинъекции ДНК - ДНК с помощью микрошприца вносят в цитоплазму или ядро клетки. Трансген может интегрировать в геном растительной клетки.

Электропорация - Через смесь протопластов и векторной ДНК пропускают короткие импульсы тока высокого напряжения. В результате в мембране образуются поры, через которые проникают молекулы ДНК.