Генная инженерия животных.

Существуют два основных способа получения трансгенных животных

1. Микроинъекция чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку

2. Получение трансгенных животных с использованием эмбриональных стволовых клеток

МИКРОИНЪЕКЦИЯ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК В ОПЛОДОТВОРЕННУЮ ЯЙЦЕКЛЕТКУ

1 ЭТАП. Создание генетической конструкции с заданными свойствами.

2 ЭТАП. Инъекция генетической конструкции в одноклеточный эмбрион - зиготу

3 ЭТАП. Введение эмбриона самке-реципиенту. Вынашивание плода и рождение животного.Не все животные будут нести чужеродный ген. Трансгенные животные часто оказываются мозаичными по введенному гену. На этом этапе следует выявить:

-Встроился ли трансген в геном

-Несут ли трансген половые клетки

-Экспрессируется ли чужеродный ген

Желательно получить трансгенного самца – от него можно получить большое потомства.

Получение трансгенных животных с использованием эмбриональных стволовых клеток. Эмбриональные стволовые клетки: являются полипотентными, могут дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков. Введенные в полость бластоцисты, дают начало любым органам и тканям химерных животных. Получены из мышей, золотистого хомячка, свиньи, овцы, коровы, обезьяны, человека и др.

ЭТАПЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭСК

1.Получение культуры ЭСК 2.Введение в ЭСК генетической конструкции.3Получение бластоцист для микроинъекции, 4Конструирование химерных эмбрионов: трансгенные эмбриональные клетки вводят в полость бластоцисты. 5 Трансплонтация химерных эмбрионов суррогатной матери. 6Генетический анализ родившихся животных 7.Скрещивание химерных самцов и анализ их потомков.8.Получение гомозиготных по введенному гену потомков

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ. Созданы трансгенные с/х животных с повышенной продукцией гормона роста. Такие трансгенные животные были обычных размеров, но у них наблюдались нарушения в росте, строения костей. Трансгенные животные – биореакторы. - Белки человека, полученные от трансгенных животных:-Антитрипсин.-Интерферон.-Фактор свертываемости крови IX.-Сывороточный альбумин.-Трофобластин. Создание животных – генетических моделей заболеваний человека. Создание трансгенных животных, источников органов для пересадки человека. В мире существует дефицит органов для пересадки человека. Решением этой проблемы может быть пересадка органов человеку от животных. Органы свиньи подходят человеку по размеру, строению, биохимическим показателям.

52. Генотерапия. Этосовокупность генноинженерных подходов, обеспечивающих внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека с целью лечения заболеваний. Задачами генотерапии являются исправление дефектов в структуре ДНК или придания клеткам новых характеристик. С помощью генотерапии удалось достигнуть успеха только при лечении моногенных наследственных заболеваний. Лечебный эффект может быть достигнут за счет: введения неповрежденной копии гена; подавления экспрессии или разрушения дефектного гена; замены дефектного гена неповрежденным; введение несвойственных организму генов, обуславливающих лечебный эффект.

Для достижения лечебного эффекта нужно: идентифицировать ген, ответственный за заболевание; создать генетическую конструкцию, содержащую неповрежденный ген и участки ДНК, обеспечивающие его экспрессию; разработать методы введения генетической конструкции в клетки больного.

МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА «ЛЕЧЕБНЫХ» ГЕНОВ. Гены можно вводить в половые клетки. Приобретенные гены будут передаваться потомству. Гены можно вводить в соматические клетки. Такой подход подразумевает трансформацию только соматических клеток. Приобретенные гены не передаются по наследству. Потомство защищено от ошибки. Пути передачи «лечебного гена»: если болезнь связана с отсутствием или малым количеством белкового продукта дефектного гена, то достаточно ввести в клетку неповрежденный ген и дать возможность ему работать. Такой подход получил название заместительной терапии. Второй способ лечения - корректирующая терапия, при помощи которой дефектный ген заменялся бы в геноме нормальной копией гена. Это можно достичь в результате рекомбинации ДНК. До практического применения этого метода еще далеко.

Методы введения ДНК в клетки. 1. Химические. 2. Физические: электропорация, микроинъекция, бомбардировка частицами, простая инъекция. 3. Опосредованное рецепторами поглощение. 4. Липосомы. 5. Рекомбинантные вирусы: аденовирусы, ретровирусы..

1.К очищенной ДНК в фосфатном буфере добавляют ионы кальция. Образовавшимся осадком обрабатывают культивируемые клетки. Только у незначительной доли клеток ДНК проникает в ядро и встраивается в геном. Эффективность переноса генов крайне низка. 2. К очищенной ДНК в фосфатном буфере добавляют ионы кальция. Образовавшимся осадком обрабатывают культивируемые клетки. Только у незначительной доли клеток ДНК проникает в ядро и встраивается в геном. Эффективность переноса генов крайне низка.

3.На микроскопические частицы металла наносится ДНК. Такими частицами обстреливают клетки. ДНК попадает внутрь клетки. Можно «обстреливать» клетки в составе тканей человека.

4.Липосомы – искусственные мембранные пузырьки способны сливаться с клеточной мембраной.Культивируемые клетки обрабатывают липосомами, заполненными раствором ДНК.Липосомы обеспечивают достаточно эффективный перенос ДНК в клетки.

5.Перспективно использование комплекса ДНК с белками, для которых на поверхности клеток имеются специфические рецепторы. После связывания белка рецептором чужеродная ДНК вместе с белком поглощается клеткой-мишенью.

6.В настоящее время на основе генетического материала вирусов создано множество генноинженерных конструкций, служащих средствами доставки генов в клетки. При создании ретровирусных векторов удаляют генетический материал, кодирующий вирусные белки, ответственные за формирование инфекционных вирусных частиц и лизис клеток.Ввместо удаленного материала вводится чужеродный ген. Элементы генома вирусов, необходимые для переноса и экспрессии клонированных генов сохраняются. Сконструированный ретровирусный вектор способен обеспечить доставку чужеродных генов, но не способен размножаться. Аденовирусные векторы обладают широкой видовой и тканевой специфичностью. При создании аденовирусных векторов удаляют генетический материал, кодирующий вирусные белки. Вместо удаленного материала вводится чужеродный ген. Аденовирусные векторы в геном не интегрируют, присутствуют в ядре клеток в виде эписом.