Нерадиоактивные методы детекции с использованием зондов, содержащих биотинилированные нуклеотиды

Этапы детекции:

-Зонд, меченный биотином, гибридизуют с ДНК-мишенью.

-Промывают фильтр для удаления избытка несвязавшегося зонда.

-Добавляют авидин (белок куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог -авидина).

-Добавляют биотинилированный фермент — щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена.

-В зависимости от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминесцентный субстрат и регистрируют изменение окраски либо люминесценцию, сопровождающую превращение субстрата в продукт.

Геномная дактилоскопия используется в судебной медицине для идентификации биологических образцов. Для проведения ДНК-типирования берут часть биологического образца (пробу крови, сперму, кусочек кожи, волосы). ДНК подвергают эндонуклеазному расщеплению. Полученные фрагменты разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нейлоновый фильтр. Проводят гибридизацию с четырьмя или пятью меченными зондами. Результаты гибридизации анализируются.

 

 

46. ДНК-фингерпринтинг

Минисателиты образованы многократно повторяющимся мономерным звеном (6-100 п.н) и имеют размер 0,2 - 20 тыс. п.н. Содержание различных классов минисателитов составляет от нескольких сотен до нескольких тысяч копий на геном

Последовательность процедур метода ДНК-фингерпринтинга:

1. Подготовка образца крови или ткани

2. Выделение ДНК

3. Фрагментация ДНК рестриктазой

4. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле

5. Перенос ДНК из геля на мембрану

6. Приготовление меченого зонда (зонд комплементарен минисателиту)

7. Гибридизация зонда с ДНК на мембране

8. Отмывка избытка меченного зонда

9. Выявление полос гибридизации

10. Анализ полученного результата

Распределение гибридизационных полос у различных индивидуумов различно, но для разных тканей оно остается постоянным. ДНК-фингерпринтинг можно использовать для идентификации личности, создания ДНК-паспартов. Распределение полос наследуется по законам Менделя, примерно половина полос от матери, другая половина от отца.

 

 

47. Молекулярно-генетический анализ

Идентификация останков на примере царской семьи

Идентификация царской семьи проводилась в 3 этапа

1. Определение пола2. Выявление семейной группы

3. Установление принадлежности семейной группы к царской семье

Определение пола

1. - Половые хромосомы X и Y несут гомологичный ген амелогенина - белка зубной эмали. Ген амелогенина в Y-хромосоме на 6 п. н. длиннее, чем в X-хромосоме. С помощью ПЦР получали фрагменты генов амелогенина. Фрагмент гена Y-хромосомы состовлял 112 п.н., -Х-хромосомы 106 п.н.. У мужчин образуется два фрагмента 112 и 106 п.н., у женщин - один фрагмент - 106 п.н. Анализ фрагментов проводили с помощью электрофореза.

2. - Для установления генетического родства используют локусы ДНК, находящиеся в 5 и более аллельных состояниях. Для выявления семейной группы был использован локус ТН 01, имеющий 5 аллельных состояний, в которых динуклеотид ЦА повторяется от 6 до 10 раз: (ЦА)₆, (ЦА)₇, (ЦА)₈, (ЦА)₉, (ЦА)₁₀.

В геноме человека могут присутствовать 1 или 2 аллеля. Аллели легко различить по размеру ПЦР-фрагментов с помощью электрофореза. Результаты анализа позволили выявить семейную группу.

3. - принадлежность семейной группы к царской семье была установлена на основании результатов фрагмента митохондриальной ДНК. Митохондриальная ДНК передается родственникам по материнской линии. Анализировали ДНК родственников по материнской линии. Анализ показал принадлежность семейной группы к царской семье.