Распространенными методами хроматографии являются аффинная хроматография, ионообменная хроматография и гель-фильтрация (эксклюзионная хроматография).

1б. Приведите пример двух молекул, которые можно было бы разделить с помощью какого-либо из этих методов.

Примером разделения белков с помощью аффинной хроматографии может служить очистка антитела на сорбенте с пришитым антигеном (на уроке нужно рассказать про взаимодействие антиген-антитело). Также примером может служить очистка фермента на аффинной подложке с ковалентно присоединенным субстратом (про взаимодействие фермента и субстрата также нужно рассказать на уроке).

Примером разделения белков с помощью ионообменной хроматографии может служить разделение двух белков с очень разными изоэлектрическими точками – например, при pH 7.2 лизоцим положительно заряжен, а альбумин отрицательно (на уроке следует рассказать про изоэлектрические точки, вклад отдельных аминокислот в заряд белка, pH и.т.п.)

2а. Какой вид хроматографии используется в данной работе?

В данной работе используется эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация).

2б. Вкратце объясните, как работает применяемый в данной работе вид хроматографии.

Когда раствор, содержащий молекулы разделяемых веществ (подвижная фаза), пропускается через колонку с сорбентом (твердая фаза), состоящим из пористых гранул, мелкие молекулы фильтруются через них и выходят из колонки позже. Крупные молекулы проходят между гранулами сорбента и выходят из колонки раньше.

3. Предположим, что с помощью гель-фильтрации разделяется следующая смесь веществ: гемоглобин (65 000 Да), миоглобин (17 000 Да), миозин (180 000 Да). В каком порядке вещества будут выходить из колонки?

Первое: миозин (самый большой)

Второе: гемоглобин (средний)

Третье: миоглобин (самый маленький)

 

4а. Если гель-фильтрационная колонка обладает пределом проникновения в 40 000 Да, гемоглобин (65 000 Да) будет разделяться на колонке или исключаться из нее?