Руководство по лабораторной работе

Поместите 12 пробирок для сбора фракций в штатив. Пронумеруйте свои пробирки цифрами от 1 до 10. Оставшиеся две подпишите как «Слив» и «Буфер». Или на штативе, или на пробирках, нужно написать также свои имена и класс.

С помощью пипетки отлейте 4 мл буфера для хроматографии в пробирку, подписанную «Буфер».

Снимите верхнюю крышку с колонки и отломите нижнюю пробку. Излишек буфера, в котором хранилась колонка, слейте в пробирку с надписью «Слив». БУФЕР НЕ ДОЛЖЕН СТЕЧЬ НИЖЕ ГРАНИЦЫ СОРБЕНТА. Затем закройте нижнюю часть колонки желтой крышкой.

 

 

Поместите колонку в пробирку для сбора фракций 1. Не надо стараться плотно вставить колонку в пробирку. Теперь вы готовы нанести образец (смесь белков) на колонку (или это сделает за вас учитель).

 

 

Снимите крышку, закрывающую нижнюю часть колонки. Пронаблюдайте, как выглядит верхний слой сорбента - весь буфер из колонки должен вытечь. Можно увидеть «зернистую» структуру сорбента. Осторожно нанесите одну каплю смеси белков на поверхность сорбента. Засуньте пипетку внутрь колонки и аккуратно капните, не повредив поверхность геля.

 

 

Дайте образцу время, чтобы войти в гель. Затем осторожно (по стенке) добавьте 250 мкл буфера. Вытекающая из колонки жидкость будет собираться в пробирку 1.

Когда вся жидкость из колонки вытечет, добавьте еще 250 мкл буфера. Также собирайте вытекающую жидкость в пробирку 1.

 

 

Когда вся жидкость вытечет, нанесите на колонку 3 мл буфера. Это можно сделать последовательно, нанеся три раза по 1 мл. Образец уже вошел в сорбент, так что легкое взмучивание поверхности не ухудшит разделение. Сразу после добавления 3 мл буфера перенесите колонку в пробирку номер «2» и начните считать вытекающие из колонки капли. Соберите 5 капель в пробирку 2.

 

 

8. После того, как вы собрали 5 капель во вторую пробирку, перенесите колонку в пробирку номер «3». Перемещая колонку от пробирки к пробирке, собирайте в каждую пробирку фракции по 5 капель..

 

 

Собирайте по 5 капель в каждую следующую пробирку, пока не дойдете до 10й. В нее соберите 10 капель. После этого опять закройте колонку крышкой. Учитель скажет вам, как вы будете хранить собранные фракции и колонку.

 

Урок 3 – анализ результатов работы. Вопросы.

1. Почему наносимый на колонку образец имел красно-коричневый цвет?

2. Как вы думаете, почему во время нанесения образца верхняя часть колонки должна быть «сухой» (над поверхностью сорбента не должно быть буфера)?

3. Почему вам нужно было добавлять дополнительный буфер после нанесения белка? (шаги 7 и 8)

4. Посмотрите на собранные вами 10 фракций. Какие из них содержат «пики» (самые большие количества) гемоглобина и витамина В12? Фракции с самой высокой концентрацией белка или витамина окрашены наиболее интенсивно.

5. Какая из молекул, гемоглобин или витамин В12, вышла из колонки первой? Эта молекула будет самой большой или самой маленькой из двух?

 

 

Приложение А. Ответы на вопросы для учителей.

Урок 1. Вопросы по теме «Хроматография»

 

1а. Назовите два разных метода колоночной хроматографии