Выявление Legionella pneumophila в объектах окружающей среды

Общее число микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре

Содержание общих и термотолерантных колиформных бактерий (ОКБ и ТКБ)

Содержание спор сульфитредуцирующих клостридий

Содержание колифагов

Пробу (в объеме 500 см3) отбирают в стерильную емкость, снабженную пробкой и колпачком, после предварительной стерилизации крана обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды уменьшают.

1.1.1. Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре.

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 оС в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Проведение анализа. Из каждой пробы делают высев не менее двух объемов по 1см3. Вносят по 1 см3 воды в две стерильные чашки Петри, затем в каждую чашку вливают 8-12 см3 расплавленного и остуженного до 45-49 оС питательного агара. Быстро смешивают содержимое чашек на горизонтальной поверхности. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют 24 часа при 37 оС.

Учет результатов. Подсчитывают все выросшие на чашках колонии, наблюдаемые при двукратном увеличении. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды. Если на двух чашках наблюдается рост расплывчатых колоний или выросло более 300 колоний, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ / см3 — ориентировочно». Если подсчет на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».

Норматив: в 1 см3 питьевой воды должно быть не более 50 КОЕ.

1.1.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий.

1.1.2.1. Метод мембранной фильтрации (основной метод). Общие колиформные бактерии (ОКБ) представлены грамотрицательными, оксидаза-отрицательными, не образующими спор палочкиами, способными расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37 оС в течение 24-48 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают их признаками и, кроме того, они способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при 44 оС в течение 24 часов.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивание посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Проведение анализа. При исследовании питьевой воды изучают три пробы объемом по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 см3 воды через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличить количество фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 см3 воды).

Фильтры помещают на чашки со средой Эндо и затем ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы 24 часа при 37 оС. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, расплывчатые, выдают отрицательный ответ, свидетельсвующий об отсутствии ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 часа.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактоза-положительных колоний: темно-красных; красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Каждую отобранную изолированную колонию исследуют на:

а) наличие оксидазной активности; б) отношение к окраске по Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена); 3) ферментацию лактозы до кислоты и газа.

.Постановка оксидазного теста. Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2-3 каплями реактива для оксидазного теста (например, 1% водным раствором тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорида) или используют СИБ-оксидазу. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое или синее (СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию их дальнейшего исследования исключают.

Определение отношения к окраске по Граму. Из оксидаза-отрицательной колонии делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена: в капле 3% водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются – реакция отрицательная.

Определение ферментации лактозы. Оставшуюся часть оксидаза-отрицательной грамотрицательной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой;

— для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при 37 оС 48 часов (просматривают через 24 часа);

— для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до 43-44 оС, и инкубируют при 44 оС 24 часа.

Учет результатов. При отсутствии ОКБ и ТКБ на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 см3» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 см3». В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число КОЕ ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 см3 воды.

Вычисление проводят по формуле X =, где Х – число колоний в 100 см3 воды; V – профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет; a – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.

Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 см3 воды, из них количество КОЕ ТКБ в 100 см3.

1.1.2.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

титрационным методом.

Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды на жидкую питательную среду с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификацией колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Проведение анализа. При исследовании питьевой воды качественным методом засевают 3 объема по 100 см3. При исследовании воды с количественным определением ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 см3, 3 объемов по 10 см3, 3 объемов по 1 см3. Посев 100 см3 и 10 см3производят соответственно в 10 и 1 см3 концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 см3 пробы проводят в 10 см3 среды обычной концентрации. Посевы инкубируют 48 часов при 37 оС. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа или только помутнение, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо для получения изолированных колоний. Посевы на среде Эндо инкубируют 18-20 часов при 37 оС.

При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактоза-положительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Факт наличия ОКБ необходимо подтвердить если: в среде накопления отмечено только помутнение; принадлежность к лактоза-положительным колониям вызывает сомнение.

В этих случаях: проверяют наличие окрашенных отпечатков на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии; выполняют оксидазный тест; подтверждают принадлежность к Граму; подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой с последующей инкубацией посевов при 37 оС в течение 24-48 часов.

Для определения ТКБ делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора среды Эндо в пробирки с лактозной средой, нагретой до 44 оС и инкубируют в термостате 24 часа при 44 оС. Допускается просмотр посевов через 4-6 часов.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактоза-положительных бактерий и выявлении их способности ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 часов при 44 оС дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Учет результатов. При исследовании 3 объемов по 100 см3 результаты оценивают качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из них, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 см3». При исследовании полуколичественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблице «Расчет НВЧ бактерий в 100 см3 питьевой воды» в методических указаниях 4.2.1018-01. Результат сообщают без доверительного интервала. При отрицательном ответе – «не обнаружены в 100 см3».

Норматив: ОКБ и ТКБ должны отсутствовать в 100 см3 воды.

1.1.3.Определение спор сульфитредуцирующих клостридий

Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 оС в течение 16-18 часов.

Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным и подсчете черных колоний.

Проведение анализа. Пробу воды 20 см3 прогревают на водяной бане в пробирках 15 минут при 75 оС для уничтожения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды прогревание пробы можно не проводить.

Из каждой пробы питьевой воды делают посев или фильтруют 20 см3. При необходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы в посевах (в фильтрах) выросло не более 10-15 колоний.

Определение методом фильтрования в пробирках. Перед посевом железосульфитный агар в пробирках расплавляют на водяной бане при 70-80 оС. После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтр стерильным пинцетом берут за два противоположных края и согнув в виде «трубочки» помещают в пробирку с горячим агаром. Пробирку с агаром быстро охлаждают в холодной воде. Посевы культивируют 16-18 часов при 44 оС.

Определение методом фильтрования в чашках Петри. Чашки Петри заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр помещают на застывшую питательную среду фильтрующей поверхностью вниз. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Посевы культивируют 16-18 часов при 44 оС.

Определение прямым посевом. В стерильные пробирки вносят по 5 или 10 см3 исследуемой пробы воды, заливают горячим железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Пробирку быстро охлаждают. Посевы инкубируют при 44 оС в течение 16-18 часов.

Учет результатов. Количественному учету подлежат только посевы, в которых получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают в колониеобразующих единицах спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 см3 воды. При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ «не обнаружены в 20 см3 воды». При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают «обнаружено в 20 см3».

Норматив: споры сульфитредуцирующих клостридий должны отсутствовать в 20 см3 питьевой воды.

1.1.4. Определение колифагов.

Колифаги — бактериальные вирусы (бактериофаги), заражающие Escherichia coli и, в результате, формирующие зоны лизиса (бляшки) бактериальной культуры, засеянной «газоном» на питательном агаре через 18 часов инкубирования при 37 оС.

Титрационный метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает предварительное накопление колифагов в среде обогащения на культуре E.coli и последующее выявление зон лизиса (просветления) газона E.coli на питательном агаре. Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.

Проведение качественного анализа. В исследуемую пробу воды объемом 100 см3 вносят питательный бульон и подготовленный смыв тест культуры E.coli, помещают в термостат и инкубируют 18 часов при 37 оС. Затем из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 см3, добавляют хлороформ, пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой, встряхивают и оставляют при комнатной температуре до полного осаждения хлороформа. В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют приготовленный смыв культуры E.coli. В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 см3 обработанной хлороформом пробы, заливают смесью расплавленного и остуженного до 45-49 оС питательного агара и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. После застывания чашку переворачивают и инкубируют в термостате 18 часов при 37 оС. Параллельно проводят контроль культуры E.coli.

Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветлении нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 см3 воды. При наличии зон лизиса в контроле культуре результат считается недействительным.

Проведение количественного анализа. Исследуемую пробу воды в количестве 100 см3 разделяют на шесть порций: 1 флакон с 50 см3 и 5 пробирок с 10 см3. К 50 см3 пробы добавляют 5 см3 десятикратного питательного бульона и 0,5 см3 смыва E.coli. В каждые 10 см3 пробы вносят по 1 см3 десятикратного питательного бульона и по 0,1 см3 смыва бактерий.

Для контроля культуры 0,1 см3 смыва E.coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Посевы инкубируют 18 часов при 37 оС.

Затем из объема 50 см3 отливают в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавляют по 1 см3 хлороформа. Пробирки закрывают резиновыми пробками, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре для осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют смыв E.coli. Приготовленную смесь разливают в две чашки Петри: одну чашку для контроля культуры E.coli на лизогенность и одну чашку для исследуемой пробы воды. После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделяют на 6 секторов и маркируют в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки наносят пастеровской пипеткой (или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости. После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку помещают в термостат при 37 оС на 18 часов.

Учет результатов. Просмотр результатов осуществляют в проходящем свете. Учитывают наличие зон просветления (лизиса) на секторах газона E.coli. При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха. Пробу считают положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Оценку проводят по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ). В протоколе анализов указывают наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды в диапазоне возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел – верхний предел) колифагов в 100 см3. Результат полуколичественный. При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считают недействительным.

Прямой метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает исследование нормируемого объема воды (100 см3) путем его прямого посева и последующего подсчета зон лизиса (бляшек) на газоне E.coli в чашках Петри с питательным агаром. Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным методом при исследовании по эпидемическим показаниям.

Проведение анализа. В питательный агар, расплавленный и остуженный до 45-49 оС добавляют смыв E.coli и перемешивают. Исследуемые 100 см3 воды разливают по 20 см3 в большие пробирки, нагревают до 35-44 оС и немедленно разливают в 5 чашек Петри. Затем в каждую чашку сразу же вносят по 20 см3 смеси агара с культурой E.coli. Для контроля культуры E.coli в одну чашку Петри вносят 20 см3 стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35-44 оС, заливают 20 см3 приготовленного агара с E.coli. Содержимое чашек осторожно перемешивают. Чашки с застывшим агаром помещают вверх дном в термостат и инкубируют в течение 18 часов при 37 оС.

Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Учет результатов осуществляют подсчета и суммирования числа бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5-7 мм в диаметре) с четко выраженными либо стертыми границами.

При высоких концентрациях фага можно наблюдать «ажурный» газон Е. coli, рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.

Окончательный количественный учет прямого посева проводят через 18 часов. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. Если отмечен сливной рост бляшек и подсчет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «обнаружено в 100 см3воды». При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

Норматив: В 100 см3 исследуемой воды должны отсутствовать БОЕ колифагов.

Выявление Legionella pneumophila в объектах окружающей среды

В настоящее время род Legionella включает около 50 видов бактерий, обитающих в пресноводных водоемах в ассоциациях с сине-зелеными водорослями и в организмах свободноживущих простейших. Большинство видов не представляет опасности для человека.

В воде легионеллы размножаются происходит в диапазоне температур, равных 25-45 оС. Условия для размножения легионелл в искусственных водных системах (системы охлаждения и кондиционирования, градирни, компрессорные устройства, джакузи, медицинское оборудование и др.) более благоприятны, чем в естественные, что и приводит к накоплению высоких концентраций бактерий. Основной фактор передачи – водный мелкодисперсный аэрозоль, образуемый системами водных коммуникаций.

Болезнь легионеров (острая пневмония с токсическим синдромом) вызывает L. pneumophila. Поражения респираторного тракта также спорадически вызывают L. micdadei и L. bozemanii. Оппортунистические заболевания могут вызывать L.micdadei, L.longbeachae, L.dumoffii и L.bozemanii, особенно при нарушениях клеточного иммунитета. Остальные виды не патогенны для человека.

Санитарно-микробиологическому исследованию на обнаружение возбудителя болезни легионеров (L. pneumophila) подлежат в порядке надзора:

1. Системы кондиционирования и вентиляции, водонагревательные и охладительные системы

2. Медицинское оборудование и инструментарий

3. Бассейны

4. Аквапарки

5. Джакузи

6. Фонтаны

Выявление L. pneumophila проводят также в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидемиологическом расследовании вспышек болезни легионеров.

Отбор проб. Пробы воды объемом 0,5-1,0 дм3 отбирают в стерильные емкости. Для дехлорирования воды используют кристаллы гипосульфита натрия.

Поверхностные и глубинные пробы отбирают специальными батометрами.

Смывы с объектов (оборудования для кондиционирования и вентиляции, водонагревательных и охладительных систем, медицинского инструментария) забирают тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором и помещают в ту же пробирку.

Поскольку легионеллы способны к образованию биопленок на синтетической и резиновой поверхности водопроводного, промышленного, лабораторного и иного оборудования, связанного с циркуляцией и хранением воды, биопленки также забирают для исследования. Соскобы влажных биопленок с поверхности, находящейся под водой или на границе воды и воздуха, берут сухими тампонами и помещают во флакон или в пробирку. С высохшей поверхности биопленки забирают тампонами, увлажненными стерильным физиологическим раствором и помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором. Доставку проб осуществляют при температуре 6-24 оС.

Подготовка проб к исследованию. В случае сильной загрязненности образцы воды фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр с помощью стеклянной воронки. Затем воду пропускают через мембранный фильтр, который переносят после фильтрации в стерильный флакон с 10 см3 физиологического раствора. Содержимое флакон 1-2 мин перемешивают на встряхивателе или 10 мин на качалке и затем центрифугируют 30 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют 1 см3 стерильного физиологического раствора и переносят в стерильную пробирку.

Для снижения уровня загрязненности сконцентрированной пробы посторонней микрофлорой одну её часть прогревают 30 мин при 50 оС, а другую обрабатывают кислотным буфером КСl-HCl (рН 2,2) в течение 4 мин.

Образцы биопленок, смывы с поверхностей концентрируют с помощью центрифугирования, кислотной и термической обработок.

Проведение анализа. Концентрированные, обработанные кислотным буфером и прогретые образцы засевают по 0,1 см3 на чашки с буферным угольно-дрожжевым агаром (БУДРАГ) с ростовой и селективной добавкой. Помещают в термостат при 37 оС до 10 дней во влажной атмосфере в присутствии СО2. Исследование посевов начинают с 2 суток. Колонии легионелл на селективной среде имеют вросший центр, зернистую или блестящую поверхность; окрашены в серовато-голубоватый или зеленоватый цвет. Идентифицируют легионеллы по морфологическим, тинкториальным (грамотрицательные палочки), антигенным свойствам (реакция латекс-агглютинации с моновалентными и групповыми сыворотками, иммунофлуоресцентная микроскопия с мечеными антителами), а также идентификацией ДНК бактерий в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Определение количества легионелл в исследуемом материале. Для определения количества легионелл проводят посев исследуемой концентрированной пробы без тепловой и кислотной обработки. Подсчитывают число колоний легионелл, выросших на чашке. Количество легионелл определяют по формуле

 

Х  cа х b s х 1000 см3

 

где

Х — количество легионелл на литр в исследуемой пробе

a — количество колоний легионелл, выросших на чашке

b — объем концентрата пробы (по завершении этапов фильтрации и центрифугирования) в см3

c — объем, высеянный на чашку, в см3мл

s — объем исходной пробы в дм3

Рекомендуемые значения для оценки уровня контаминации Legionella pneumophila объектов окружающей среды.

1. Присутствие L. pneumophila в воде различных объектов окружающей среды, воде бассейнов, аквапарков, джакуззи, систем кондиционирования воздуха и др. в концентрации менее 1 х 102 микробных клеток на дм3 является допустимым и не требует проведения профилактических мероприятий.

2. Концентрация легионелл в диапазоне от 1 х 102 до 9 х 103 микробных клеток на дм3 не представляет эпидемической опасности, но требует ежемесячного микробиологического контроля и проведения профилактических мероприятий.

3. При обнаружении легионелл в концентрации 1 х 104 микробных клеток на дм3 и выше делают вывод о колонизации данного объекта легионеллами в концентрации, представляющей эпидемическую опасность и требующей дезинфекционных и профилактических мероприятий.