Методы лабораторной диагностики

В настоящее время для определения этиологии конъюнктивитов и кератитов применяют следующие методы лабораторной диагностики

- непосредственное определение возбудителя в соскобе (цитологический метод с окраской по Романовскому и по Граму, иммуно-ферментный, иммунофлюоресцентный, полимеразная цепная реакция - ПЦР);

- выделение хламидий и микоплазм в культуре клеток — культуральный метод, который считается эталонным;

- серологические тесты.

Результаты лабораторной диагностики зависят от тщательности выполнения процедуры забора патологических клеток конъюнктивы или роговицы. Применяют соскобы с конъюнктивы и мазки-отпечатки с конъюнктивы и роговицы.

Для забора соскобов необходимы следующие манипуляции: после эпибульбарной однократной анестезии с конъюнктивы верхнего и нижнего века с помощью одноразовых зондов-пробоотборников забирают клетки с патологически измененной конъюнктивы. Материал наносят на обычные предметные стекла, сушат в течение 8-10 мин на воздухе и фиксируют ацетоном, после чего предметные стекла с фиксированным материалом рекомендуется в течение 1 ч транспортировать в микробиологическую лабораторию.

Мазки-отпечатки берут с конъюнктивы нижнего века или роговицы, что позволяет повысить достоверность лабораторной диагностики. С помощью пинцета покровную пластинку прижимают к конъюнктиве век, глазного яблока или непосредственно к роговице после эпибульбарной анестезии любым анестетиком. Затем мазок-отпечаток сушат на воздухе в течение 5 мин и фиксируют метиловым спиртом. Транспортировку материала необходимо осуществлять в течение 1 ч после его забора.

Цитологический метод. Этот простой и доступный метод при острых или хронических конъюнктивитах дает много дополнительной информации для уточнения этиологии воспалительного процесса. При использовании специальных окрасок (по Граму и Романовскому) можно выявить хламидийные включения, разнообразную бактериальную флору, мицелий грибов, воспалительные клетки, измененные ядра и цитоплазму клеток конъюнктивы и роговицы. Диагностическая ценность данного метода зависит от внимательности исследователя.

Для бактериальных конъюнктивитов характерны обнаружение большого количества нейтрофилов, отсутствие изменений эпителиальных клеток. При вирусных конъюнктивитах обнаруживают дистрофичес­кие изменения эпителиальных клеток. В экссудате преобладают лим­фоциты имакрофаги. При аллергических конъюнктивитах в экссу­дате преобладают эозинофилы и базофилы.

Прямая иммунофлюоресценция — достоверный и специфичный метод. Соскобы с конъюнктивы глаза окрашивают родоспецифическими моноклональными антителами хламидий, вируса простого гер­песа типа 1 и2, аденовируса. Данные антитела представляют собой моноклональные мышиные антитела, специфичные к определенному антигену. При люминесцентной микроскопии хламидий и вирусы выявляются либо в пораженных клетках в виде характерных цито-плазматических включений, окрашенных в зеленый цвет, либо внеклеточно в виде отдельных образований, окрашенных в ярко-зеле­ный цвет.

Культуральный метод является дорогостоящим и трудоемким. К отрицательным сторонам этого метода следует отнести длитель­ность культивирования (48—52 ч). Однако возможность получения четких результатов даже при минимальном присутствии микрофлоры является важным преимуществом культурального метода.

Для идентификации и дифференциального титрования микоплазм используют специальный набор. Данная методика позволяет культи­вировать, а также идентифицировать микоплазмы. Идентификация и титрование микоплазм основаны на специфических свойствах мик­роорганизма, который гидролизует мочевину (Ureaplasma urealiticum) или аргинин (Ureaplasma hominis). При этом образуется ион аммония и происходит защелачивание среды. Вследствие этого изменяется цвет индикатора кислотности среды, что позволяет визуализировать реак­цию. Титр микоплазм выражается в количестве единиц изменения цвета (ЕИЦ) на 1 мл пробы. Культивирование позволяет определить титры порядка 103/мл, которые уже считаются патогенными.

ПЦР позволяет непосредственно определить специфический учас­ток последовательности ДНК для любого известного микроорганизма и вируса.

Серологические методы имеют второстепенное значение. Исполь­зуют различные иммунные реакции, оценивается диагностический титр (1/64). Но даже при достоверно положительном титре для опре­деленной инфекции в сыворотке крови невозможно установить лока­лизацию патологического процесса и достоверно определить стадию заболевания.

В стадии разработки находится метод определения иммуноглобулинов различных классов в слезной жидкости. Обсуждается вопрос диагностической ценности этого метода и его помощи в постановке диагноза хламидийного поражения органа зрения. Чаще всего иммуноферментным методом определяют секреторные иммуноглобулины класса А и G. Считается, что появление в слезной жидкости иммуноглобулинов различных классов связано с несколькими причинами. Во-первых, это транссудация их из крови, во-вторых, активизация локального иммунитета непосредственно в органе зрения.

Проводят забор слезной жидкости с последующим проведением серологического анализа.

Методика забора слезной жидкости

Для забора слезной жидкости может быть использован пипеточный дозатор. Слезную жидкость собирают в стерильные пробирки Эпиндорфа. С помощью пластиковой насадки, которая имеет округлый край и закрепляется на пипеточном дозаторе, из нижнего конъюнктивального мешка собирают слезную жидкость. Предварительную эпибульбарную анестезию конъюнктивы и глазного яблока не проводят. Не рекомендуется использовать какие-либо химические вещества, стимулирующие слезоотделение. Пациентов просят смотреть кверху во время всей процедуры. Слезная жидкость собирается в течение 7—15 мин из нижнего конъюнктивального мешка обоих глаз, достаточно около 1 мл слезной жидкости. Биологический материал непозднее 2 ч после забора при комнатной температуре необходимо транспортировать в иммунологическую лабораторию.

Серологический анализ слезной жидкости включает определение чаще всего иммуноглобулинов класса А и G. Используют метод иммуноферментного анализа (ИФА), который обладает высокой специ­фичностью и чувствительностью. Чаще всего диагностический титр в таких тест-системах составляет 1/32. Соответственно результаты с тит­ром менее 1/32 считаются отрицательными для определения антител к IgA и IgG.