Виготовлення зрізів.

Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 2225

Свіжий матеріал ріжуть бритвами від руки або за допомогою заморожуючого, ротаційного і санного мікротомів. Для одержання ультратонких зрізів товщиною 90 – 100 нм застосовують ультрамікротоми [1].

На спеціальному столику заморожуючого мікротома в краплині води розмішують препарат. До нього під тиском для заморожування об'єкта подають стиснений вуглекислий газ. У деяких мікротомах охолоджується не столик, а ніж. Зразок при цьому легко ріжеться, але зрізи виходять менш тонкі, ніж на ротаційному і санному мікротомах. Крім того, неможливо зробити безперервну серію зрізів. Проте метод не потребує складної попередньої обробки матеріалу, а прилад простий в експлуатації.

При виготовленні зрізів бритвою від руки поверхню матеріалу вирівнюють гострим ножем або ланцетом. М'які частини рослин (листки, молоді стебла тощо) затискають між шматочками серцевини бузини, соняшника, бульби картоплі, корка, пінопласту. Зрізи знімають з леза бритви препарувальною голкою або пензликом, їх розглядають у воді, а також у 70 %-му розчині гліцерину. В разі потреби зрізи підфарбовують. При спостереженні живих препаратів застосовують прижиттєві (вітальні) барвники — метиленовий синій і нейтральний червоний.

Парафінові зрізи перед фарбуванням потрібно депарафінувати. Найчастіше для цього застосовують ксилол, який потім заміщують на 96 %-й етанол. Останній екстрагують із зрізів водою. Такі зрізи вже можна фарбувати. Застосовують барвники, які фарбують тканину без протрави (субстантивні) і після попередньої її протрави (аджективні). Для кислих барвників як протраву використовують оксиди тривалентних металів — алюмінію, хрому, а для основних — танін.

Для освітлення препаратів, у тому числі і тотальних. застосовують суміш гліцерин — вода (1:1, 2:1), хлоргідрат — вода (5:2, 8:2), КОН (5 - 7 %-й водний розчин), жавельову воду і лактофенол.

4. Фарбування препаратів.

Забарвлення зрізів необхідне для посилення їх контрастності та виявлення тих або інших структур, Розрізняють прогресивне і регресивне фарбування. При прогресивному методі слабким розчином барвника забарвлюються тільки деякі елементи клітини. Хід процесу контролюють під мікроскопом. При регресивному методі всі частини зрізу під дією концентрованих розчинів барвників стають кольоровими. їх пізніше диференціюють відмиванням водою, підкисленим соляною кислотою етанолом і водним розчином галунів. Диференціювання зрізів проводять під мікроскопом, стежачи за знебарвленням їх [1].

Залежно від мети забарвлюють лише певні клітинні структури або всі елементи зрізу. Наприклад, від розчину сафраніну здерев'янілі та зкорковілі клітинні стінки набувають червоного кольору. Для виявлення лігніфікованих структур часто використовують також розчин флороглюцину, аміачного фуксину, гематоксиліну і генціанового фіолетового. Від хризоїдину лігніфікований матеріал стає червоно-жовтим, а йодного зеленого — зеленим.

Целюлоза забарвлюється такими специфічними барвниками, як анілінблау, малахітовий зелений і бісмарк коричневий. Тіонін, метиленовий зелений і метиленовий синій використовують для виявлення флоеми. Під дією хлор — цинк — йоду стінки ситовидних трубок стають фіолетовими, а їх вміст залишається жовтим. Хлор цинк — йод фарбує також ядра клітин у бурий колір, а крохмальні зерна у фіолетовий.

Добрі результати дає комбіноване фарбування сумішшю кількох барвників. Так, при обробці зрізів розчином сафранін+водний синій здерев'янілі частини клітин стають червоними, а нелігніфіковані – синіми. Аніліновий синій+сафранін забарвлює здерев'янілі структури і ядро в червоний колір, а нелігніфіковані —у синій. Ефективним є фарбування зрізів карболовим фуксином і пікроіндигокарміном, при якому здерев'янілі оболонки набувають червоного кольору, нелігніфіковані - голубого, цитоплазма — смарагдово-зеленого, а кутикула — рожево-фіолетового. Уявлення про диференціацію забарвлення анатомічних структур дають постійні препарати фабричного виготовлення.

Для виявлення тих або інших сполук у клітинах і тканинах та локалізації їх застосовують цитохімічні і гістохімічні методи дослідження. Для порівняльної оцінки мікрокількостей речовин використовують шкали з оцінкою в балах або більш точні методи цитофотометрії і цитоспектрофотометрії. Мікрохімічні реакції, проедені безпосередньо на зрізах, дають змогу виявити наявність сполук і процесів при збереженні структурної цілісності об'єкта.